种公猪精液中与繁殖障碍有关的6种病毒的检测（二）
发布: 2010-04-03 | 作者: 孙泉云1，周锦萍1，张维谊1，曹建国2， | 来源: 现代化养猪信息网
(1.上海市畜牧兽医站，上海 201103；2.上海市农业科学院畜牧兽医研究所，上海 201106)
1.2.2 病毒RNA 的提取
取待检样品200 μL，加入600 μL Trizol试剂，颠倒混匀；再加入200 μL三氯甲烷，颠倒混匀，室温放置5 min,12 000 r/min离心15 min；取500 μL上清置于新的经DEPC水处理过的 1.5 mL灭菌离心管中，加入500 μL预冷的异丙醇，颠倒混匀，室温放置5 min,12 000 r/min 离心15 min；轻轻弃上清，倒置于吸水纸上，加入预冷的700 μL浓度为750 mL/L乙醇，颠倒洗涤，12 000 r/min 离心5 min～10 min；弃上清，将离心管倒扣于吸水纸上1 min，短暂离心，用微量加样器吸干残液；室温干燥3 min～5 min(以无乙醇味为准)，加入10 μL～30 μL DEPC水，轻轻混匀，溶解RNA，置－20 ℃保存备用。
1.2.3 病毒DNA的提取 取待检匀浆上清液250 μL，加500 μL buffer V-A混匀，室温静置5 min；加125 μL buffer AP2，和125 μL buffer V-B，颠倒混匀；12 000 r/min离心5 min，取850 μL上清于装有柱子的2 mL离心管中；5 000 r/min离心1 min，弃废液，加700 μL buffer W1A；6 000 r/min，离心1 min，弃废液，加700 μL buffer W2漂洗液；12 000 r/min离心1 min，弃废液，加700 μL buffer W2漂洗液；12 000 r/min离心1 min，将柱子套入一新的1.5 mL管，加40 μL buffer TE；室温放置1 min,12 000 r/min离心1 min；管中收集的即为提取的病毒DNA，置－20 ℃保存备用。
1.2.4 6种疫病的PCR反应体系、反应条件和结果判定
1.2.4.1 PRV检测
设计引物，扩增猪伪狂犬病病毒基因中434～651碱基对(bp)之间217 bp片段。引物序列为上游引物P1：5′-CAG GAG GAC GAG CTG GGG CT-3′； 下游引物P2：5′-GTC CAC GCC CCG CTT GAA GCT-3′。
PCR反应体系为10×PCR buffer(含MgCl2 )2.5 μL，dNTPs(2.5 mmol/L) 2.0 μL，引物(25 pmol/μL)各1 μL，TaqDNA聚合酶(5 U/μL) 0.5 μL，DNA模板4.0 μL，加双蒸水至25 μL。PCR反应条件为：94 ℃ 3 min；94 ℃ 1 min,65 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min,40个循环；72 ℃ 5 min。取5 μL PCR产物在11 g/L的琼脂糖凝胶上进行电泳(100 V，30 min)，在凝胶成像系统上观察目的片段。
1.2.4.2 PCV检测 设计引物，其序列为上游引物P1：5′-CCG CGGGCTGGCTGAACTT-3′； 下游引物P2：5′-ACCCCCGCCACCGCTACC-3′；预期扩增片段大小为1 154 bp。
PCR反应体系为：10×PCR buffer(含MgCl2 )2.5 μL，dNTPs(2.5 mmol/L) 2.0 μL，引物(25 pmol/μL)各1 μL，TaqDNA聚合酶(5 U/μL) 0.5 μL，DNA模板4.0 μL，加双蒸水至25 μL。
PCR 反应条件为：94 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min，53 ℃ 1 min,72 ℃ 1 min， 35个循环；72 ℃ 7 min。取5 μL PCR产物在11 g/L的琼脂糖凝胶上进行电泳(100 V 30 min)，在凝胶成像系统上观察目的片段。
1.2.4.3 PPV检测 PCR反应体系为总体积20 μL。取16 μL PCR反应液、2 μL TaqDNA聚合酶、2 μL模板DNA混匀。PCR 反应条件为：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,35个循环；72 ℃ 7 min。取5 μL PCR产物在11 g/L的琼脂糖凝胶上进行电泳(100 V,30 min)，在凝胶成像系统上观察目的片段。预扩增片断大小为313 bp。
1.2.4.4 JEV检测 PCR反应体系：每份总体积25 μL。取RT-PCR反应液21.5 μL，RNA酶抑制剂0.3 μL，反转录酶0.2 μL，TaqDNA聚合酶1 μL，模板RNA 2 μL。RT-PCR 反应条件：42 ℃ 45 min；94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s，35个循环；72 ℃ 5 min。取5 μL PCR产物在11 g/L的琼脂糖凝胶上进行电泳(100 V,30 min)，在凝胶成像系统上观察目的片段。预扩增片断大小为375 bp。
1.2.4.5 CSFV和PRRSV检测
反应体系为每2个样品需要个1酶球、40 μL RT-PCR反应液，计算好各试剂的使用量，加入适当体积的试管中，充分混匀
