用重组蛋白NcSAG1t作为ELISA诊断抗原进行土种藏系羊Neospora caninum的血清学诊断
发布: 2010-04-03 | 作者: 沈艳丽 马利青 | 来源: 《中国兽医杂志》|青海省畜牧兽医总站,青海 西宁 810000
Neospora caninum是原生动物顶器门一种原生动物性寄生虫，它最早是在一条发生瘫痪的狗上被确诊的。直到1988年，人们一直错误的把N.caninum当作Toxoplasma gondii，因为这两个寄生虫在形态学上是极为相似的。认为N.caninum是引起胎儿流产和新生犊牛死亡以及狗的神经肌肉麻痹症的主要原因。就现在掌握的资料，狗是惟一的能够排泄N.caninum卵囊的终末宿主。
N.Caninum首次在羊上确诊是在英国。这是在历史上首次报道，小反刍动物疑似N.Caninum感染病例。羔羊出生时表现虚弱，部分共济失调，一周后死亡，在腹侧部发生单侧性的灰色变形。这种病例在以前的研究中已经进行了报道，它的原因主要归咎于弓形虫体引起的自然残疾。但是，在许多种动物（包括人）上仅仅观察到了N.Caninum组织包囊，但没有观察到其速殖子。随后在日本有了羊发生新孢子虫病的临床报道。
在N.caninum的诊断中，现在已经建立了一些血清学诊断方法，诸如免疫荧光抗体方法、ELISA、竞争抑制ELISA、蛋白印迹和用全虫体速殖子或从速殖子提取抗原，直接进行凝集试验来检测牛和羊的N.caninum的抗体。但是，使用这些全虫体速殖子或来自速殖子的抗原出现一些无法避免的问题，由于这些抗原与它相近虫体T.gondii间存在交叉反应，容易产生假阳性。因此，需要建立一个可靠的、敏感的和特异性的诊断方法用来检测N.caninum的特异性抗体。
N.caninum的表面抗原1（NcSAG1）在建立诊断新孢子虫病的方法上是一个重要的诊断抗原。在以前的研究中已经完成了基因编码的NcSAG1t在E.coli上的克隆和表达。在本研究中进行了ELISA诊断方法的建立，并且用纯化的GSTNcSAG1t作为ELISA诊断抗原，进行了土种藏系羊N.caninum抗体的检测。
1 材料与方法
1.1 GSTNcSAG1t 在以前的研究中进行了克隆、表达和纯化。
1.2 阴、阳性标准血清 均为日本国家原虫中心玄学南博士惠赠，青海省畜牧兽医科学院兽医所生物技术研究室保存。
1.3 被检血清的采集和处理
273份被检血清均采自青海省玉树藏族自治州的治多县和称多县的羊群，其中：123 份采自治多县；另外的 150 份采自称多县。采血时均空腹、颈静脉采集，采集后摆成斜面，置
1.4 其他试剂和耗材 均购自国内和 Sigma 公司供应商。
1.5 ELISA
1.5.1 抗原的包被 抗原GSTNcSAG1t和GST，按5 μg/ml 剂量加到包被液中（50 mM carbonate bicarbonate buffer, pH 9.6），混匀后加到96孔平底微量板（Nunc, Denmark）的孔里，每孔50 μl，并且在4℃条件下培养过夜。
1.5.2 封阻 用含有0.05% Tween 20 的PBS冲洗液冲洗1次后，残留的粘附物的部位用含3%脱脂乳的封阻液进行封阻，每孔100 μl，并在37℃条件下培养1 h。
1.5.3 加样 随后微量板用冲洗液冲洗1次，在封阻液中按1∶100滴度稀释被检血清后，每个样品平行加到微量板的两个孔中，每孔50 μl，并在37℃条件下培养1 h。
1.5.4 加二抗 用冲洗液冲洗6次后，在封阻液中按1∶4 000滴度稀释辣根过氧化物酶结合了兔抗羊的IgG抗体（Bethyl Laboratories,USA），稀释后每孔加50 μl，并在37℃条件下培养1 h。
1.5.5 底物 用冲洗液冲洗6次后，每孔加100 μl底物，每毫升底物中含有0.3 mg的2,2′azinobis(3ethylbenzthia zoline6 sulfonic acid)，0.1 mol柠檬酸，0.2 mol磷酸缓冲液和0.003% H2O2，每孔加100 μl。
1.5.6 读数 用Wellscan MK 3 酶标读数仪在光吸收值OD415nm条件下测定光吸收值。
1.5.7 判定标准 ELISA滴度表示成最大稀释度的倒数，且展示ELISA值是等于或大于0.1，在抗原GSTNcSAG1t 孔和 GST 孔之间的光密度吸收值是不同的，两孔阴性血清对照孔的平均值必须低于0.1，样品ELISA抗体滴度值等于或大于0.1为阳性，低于0.1为阴性。
2 结果
调查表明，所检测的273份被检血清中，共检出N.caninum抗体阳性血清25份，阳性率为9.16%。其中：在123份引进的小尾寒羊中检出了11份阳性，血清学阳性率为8.94%；在150份当地繁殖的小尾寒羊中检出了14份阳性，血清学阳性率为9.33%。
从本次的检测结果来看，初步说明作为我省优势畜种的土种藏系羊羊群中存在N.caninu
m的感染。
3 讨论
3.1 已知NcSAG1是N.caninum的表面抗原，并且证实是一个免疫显性抗原。因此，NcSAG1在检测动物N. caninum上是一个重要的诊断抗原，在本研究中对ELISA诊断价值进行了评估。
3.2 由于NcSAG1于T.gondii的SAG1在遗传上来源于同源，两者之间具有交叉反应。因此，一些人认为在使用SAG1时容易产生假阳性结果。但大量的试验数据已经证明用NcSAG1作为ELISA诊断抗原，检测试验感染了T. gondii实验鼠的血清时，不会产生交叉反应。在另外的研究中也证实，用重组的T.gondii的SAG1作为 ELISA 诊断抗原，检测试验感染了N.caninum实验鼠的血清时，也不会产生交叉反应。
3.3 Kobayashi等(2001)发现在母羊和它的双胞胎中自然感染新孢子虫病。主要症状为脑炎，并且N.Caninum组织包囊厚壁在 3 只羊上均能观察到。Koyama等(2001)首次从另外的成年母羊上分离得到了N.Caninum。对绵羊自然感染N.Caninum的血清流行病学不清楚，并且也没有发现证明N.Caninum是引起田间绵羊流产的重要证据。
3.4 在最近的一项英国的调查研究中，在660只流产母羊中仅仅3只羊能检测到N. Caninum的血清抗体。可是，妊娠绵羊在实验感染条件下犬对新孢子虫速殖子的是高度易感，并且对牛新孢子虫病的反刍动物模型也是如此。羊可以经口服N.Caninum 卵囊而感染。
3.5 我国尚未开展有关N.caninum在羊群中流行情况的调查。本研究工作为我们今后开展该领域流行病学调查奠定了基础。
