摘 要：从4头同期发情与超数排卵的因重复采胚不孕的供体波尔山羊卵巢采得24枚卵泡卵母细胞（18枚卵丘卵母细胞，6枚裸卵），其中9枚卵丘卵母细胞直接与获能后的精子实施配子移植，4头受体均未受孕；其余15枚进行26h成熟培养，经培养后其中9枚卵丘卵母细胞中有6枚卵丘扩散，3枚未扩散；6枚裸卵因均退化而弃去。9枚卵丘卵母细胞移植至4头受体后有两头妊娠并如期产羔各一头。
 关键词：波尔山羊，卵泡卵母细胞，输卵管配子移植
  配子输卵管内移植术（gamete intrafallopian transfer，GIFT）是直接将供体成熟的卵母细胞和经获能处理的精子共同移植到受体输卵管内使其受精与妊娠的一种助孕技术。1984年，Asch RH等首次利用腹腔镜进行配子输卵管移植在人体获得成功[1]。如今配子输卵管内移植术（俗称礼物婴儿）已开始在人类不孕症临床治疗中采用。2001年Carnevale EM等对马的配子移植进行研究，结果表明卵母细胞经过成熟培养后和获能精子一起移植到输卵管中，成功率较高。同时阐明，进行配子移植时，精子获能是非常重要的环节，这可能与配子移植到输卵管中的部位有很大关系[2]。而在其它哺乳类动物中尚未见成功的报道。在家畜胚胎移植过程中往往会遇到这样一些情况。如供体的输卵管因多次手术而粘连堵塞，子宫炎症反应，或者其它的受精障碍，这些都会影响供体正常的排卵、受精与胚胎采集。配子移植作为其辅助技术可以解决这一问题。本研究拟利用经多次胚移手术不能正常繁殖的成年波尔山羊为试验材料，将采得的波尔山羊卵母细胞进行成熟培养，同时严格进行精子获能操作，把成熟后卵母细胞和获能精子移植到受体山羊的输卵管内，尝试波尔山羊配子技术的可能性，初步探讨卵母细胞的成熟培养对提高配子移植成功率的影响，以作为MOET技术辅助手段，为进一步挖掘波尔山羊繁殖潜力探讨新途径。本文报道该项研究成果。
1 材料与方法
1.1 实验动物
供体羊为经多次重复超排与采胚手术后发情而屡配不孕的4头波尔山羊。受体羊12只，均为徐淮白山羊。所有供、受体羊均采用舍饲，进行常规饲养管理。
1.2 试剂及培养用液
进口阴道孕胴栓CIDR (Pharmacia&Upjohn )；FSH (Jurox LtD Australia 12789)；氯前列烯醇（PG，上海市计划生育研究所提供）；孕马血清促性腺激素（PMSG，宁波第二激素厂生产，批号：010705）；全身麻醉剂846(解放军农牧大学兽医研究所提供)；采卵液为D-PBS液（含40μg /mL肝素钠，无BSA）；卵子操作液为含10%BSA的D-PBS液；精子获能液为BO液（不含G,BSA）+咖啡因（42.4mg/100mL）+肝素钠（10μg/mL）；精子操作液为含10%FCS的Ham"sF-10。
1.3 实验方法 
1.3.1 供、受体羊同期发情和超数排卵处理:供、受体羊均用进口阴道栓（CIDR）放置15d结合氯前列烯醇(PG)作同期发情处理。供体羊采用促卵泡素（FSH）作超数排卵处理。为保证受体羊的同期发情率，采用PMSG和PG做第2次同期发情处理。
1.3.2 山羊EGS的制备（耳缘静脉采血）:羊发情后进行颈静脉采血。37 oC 水浴放置30min，离心两次（500r/s，10min）分离出血清。56 oC的水浴中30min灭活血清分装于保存瓶中，备用（-20oC）。使用前用0.22μm过滤器过滤除菌，按比例添加入卵母细胞成熟培养液中。
1.3.3 卵泡卵母细胞的采集:供体羊于发情后17～20h内用自制采卵装置对卵巢上直径2～6mm的卵泡进行手术采卵，采卵用试管中预先加入少许预热采卵液，采集完毕后，将试管静置约5min，使采得的卵母细胞沉于底部，用无菌滴管吸出底部的采卵液于体视显微镜下拣卵。形态分级，挑选颗粒细胞层完整或基本完整、胞质均匀的卵丘-卵母细胞复合体（COC），用含BSA的D-PBS洗涤3遍。
1.3.4 卵母细胞体外成熟培养:将获得的卵丘-卵母细胞（COC）用成熟培养液洗涤2遍，移入成熟培养液微滴中培养。培养条件为39℃、5% CO2、饱和湿度。培养液微滴上覆盖矿物油，使用前在CO2培养箱中平衡过夜。培养时间约26h。
1.3.5 卵母细胞成熟判定:卵丘-卵母细胞成熟培养过程中注意观察卵丘细胞扩散情况，如卵丘扩散良好呈辐射状，判定卵母细胞成熟。用吸管吹打去除外层颗粒细胞后，将成熟卵母细胞置于培养箱中备用。
1.3.6 精液处理及获能:采集波尔羊新鲜精液，加入2mL预热精液稀释液，吸打均匀后离心（1800r/min，5min），弃上清。沉淀中加入2 mL精子获能液，再离心1次（1800r/min，5 min），弃上清，加入2mL精子获能液于培养箱（39℃、5% CO2、饱和湿度）中Swim­up获能1.5h，显微镜下检查精子活力，调整其密度至4×107个/mL，保存于CO2培养箱中备用。
1.3.7 GIFT操作:腹中线切开术取出受体山羊子宫角与输卵管，采用特制移植管，依次吸入5μL卵子操作液、30μL获能精子、空气、10μL含卵操作液、空气和5μL卵子操作液，一并移植于±12h同期发情的受体输卵管伞部约3cm处，于实体显微镜下检查移植管内是否有卵母细胞遗留。
1.3.8 受体饲养管理:移入配子的受体加强管理并进行疾病预防，维持较高的营养水平，观察并记录返情和流产情况。凡经过3个发情周期后未返情者判定为妊娠；反之，则判定为未妊娠。
2 结果
2.1 同期发情
经超排处理的4只供体波尔山羊，于12 h内均相继发情，同期率达100%。
2.2 卵泡卵母细胞的采集
用自制采卵装置共穿刺卵泡约40个，实体显微镜下捡卵，共获得24枚卵母细胞，其中18枚卵丘卵母细胞（COC），6枚裸卵，回收率达60%。
2.3 卵母细胞的成熟培养
将获得的18枚卵丘卵母细胞中的9枚不进行体外培养直接实施移植，另外9枚和6枚裸卵置于培养箱中培养，8h后观察到卵丘细胞开始明显扩散，继续培养，26h后观察发现其中6枚卵丘细胞充分扩散呈辐射状判定为成熟，另3枚卵丘细胞扩散不均匀。6枚裸卵均未观察到第一极体，卵周隙明显变大，细胞质中有空泡出现，判定已经开始退化。
2.4 精子处理及获能
在移植前3h采集优良种波尔山羊鲜精，按上述方法获能处理后，显微镜下检查精子活力约0.8，可用作移植。
2.5 配子移植
9枚未进行成熟培养的卵丘卵母细胞与获能精子共同移植到4只同期发情的受体母羊输卵管中，在其后的两个情期内4头受体羊均出现返情；另外9枚经成熟培养的卵丘卵母细胞也移植到4只同期发情的受体母羊输卵管内，结果有两头受体一直未出现返情现象，并分别足月产下一羔；6枚裸卵因退化弃去未用于移植。移植详情见表1。

2.6 妊娠判定与产羔
被移植配子的8只受体母羊中，未经体外培养成熟的卵子移植后J012和J073第一情期返情，J016和J062在第二个情期返情，妊娠率为0；经体外培养成熟的卵子移植后，其中J060出现两次返情，J004出现一次返情。J008和J068未返情，并分别如期各产下1只母羔，分娩率为50%。
3 分析与讨论
3.1 卵母细胞的成熟培养
本研究中未经体外成熟培养的卵移植后均没有妊娠，说明卵母细胞的成熟培养是配子移植的关键环节之一。目前有关山羊卵泡卵母细胞的成熟培养多采用TCM199+激素（FSH或PMSG）+血清，有人用TCM199和Ham"s F12培养液进行比较 ,结果表明 ,TCM199略优于Ham"s F12 ,即分别达到79.4%和76.3 % [3]。成国祥等研究表明 ,卵母细胞在TCM199培养液（添加 HCG、E2 激素以及发情羊血清）中最高成熟率达83.67%，而且使用EGS的成熟率高于使用FCS的成熟率[4]。张涌等研究发现,在添加FCS体积分数为10%～15%时 ,添加一定比例的激素 (1～2mg/L 1 7β-E2∶2 0～50mg/L LH∶10mg/L FSH)有利于卵母细胞核成熟 ,极体排出率高且形态正常；核成熟后再培养3～4h,有利于胞质成熟[5]。刘海军等以同样的培养系统培养卵泡卵母细胞，成熟率为80.4%[6]。本研究以TCM199+10µg/mL FSH+20µg/mL LH+10%EGS培养系统培养9枚波尔山羊卵丘卵母细胞，其中6枚扩散良好，成熟率为66.6%。 EGS为同种血清且在发情期有较高内源激素水平,有利于卵母细胞的成熟。用EGS取代FCS培养卵母细胞不仅价廉,且能获得较高的成熟率。
3.2 精子获能
影响配子移植成功率的另一重要因素是移植精子的活力情况。Guzick DS等对GIFT技术实施结果进行了统计分析，表明精子的活力与精子形态比精子的密度更为重要。移植用精子浓度的高低对配子移植的成功率并无显著的影响[7]。Khan I 对307例GIFT技术的移植结果作了统计。移植用精子浓度从100000梯度降至2500，发现精子浓度的降低并没有降低流产率，同样，妊娠率的差异也不显著[8]。精子获能对温度有很大的依赖性，一般动物精子在37～38℃下即可达到获能，山羊精子在39℃下比较容易获能。精子体内获能的活性物质是发情期输卵管液中的氨基多糖 (GAG)。GAG可促使精子对钙离子的吸收,从而诱发顶体反应。肝素是高度硫酸化的GAG,自Parrish首次报道了应用肝素诱导牛精子体外获能取得成功后 ,已相继在牛、猪和山羊体中取得成功。除促进多种动物的精子获能外,肝素还具有促进卵内原核发育的作用，咖啡因能增强肝素的作用[9]。本研究首先洗涤山羊新鲜精子，这样可以去除精浆中的去获能因子和其他不利因素，让精子在含有肝素和咖啡因的获能液中Swim­up,检查精子活力，精子运动能力明显增强，获得较好的获能结果。
3.3影响配子移植的其它因素 
配子移植的影响因素很多，其中卵子发育质量和精子的活力可能是主要因素[7]。此外，GIFT技术的成功率也随移植的卵细胞数和供、受体羊生殖生理周期的同步化程度密切相关[10]。 1989年，Yee B等在进行人的配子移植研究中发现配子移植到输卵管中的深度与移植成功率具有一定的关系。当配子移植到输卵管内的深度超过4cm时，妊娠率为69.6%，而移植到输卵管内3～4cm之间时，妊娠率只有41.2%，而且移植的卵母细胞数越多，成功率越高[11]。Sayama M等比较了配子输卵管移植与体外受精的受体妊娠率及产仔率，结果表明配子输卵管移植的受体妊娠率和产仔率比体外受精均要高（分别为44.2%：31.0%，33.4%：22.9%）[12]。本研究受实验动物数量限制，未能深入探讨诸如移植卵母细胞数目，移植到输卵管内的位置，移植方式等多种因素对配子移植的影响，有待于进一步进行研究。