猪源性链球菌的耐药性分析
发布: 2009-05-22 | 作者: 佚名 |
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医学院动物医学院，锦州 121001）
摘 要：为了找到对猪链球菌病疗效较好的药物，本实验用平皿二倍稀释法，测定了临床分离的27株链球菌的MIC，耐药性监测的结果表明链球菌对所测12种药物有11种产生了不同程度的耐药性，只有盐酸克林霉素和阿莫西林对临床所分离的链球菌比较敏感，MIC50分别为0.125µg/mL、4µg/mL。
关键词：猪；链球菌；耐药性
猪链球菌病是养猪场的一种常发病，近几年此病有上升的趋势，许多猪场的哺乳仔猪和断奶仔猪不同程度地感染链球菌，发病率和死亡率均较高，少数育肥猪和种猪则以关节炎型为主，虽然死亡率不高，但是影响生产性能。目前，对于猪链球菌病的防治主要是以注射自家灭活苗以及应用青霉素类、头孢类抗生素、氨基糖苷类、林可胺类、大环内酯类以及喹诺酮类药物。通过对猪链球体外抑菌试验，为研究链球菌的耐药性做了铺垫，并为进一步消除耐药性打下了基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株 质控菌株 肺炎链球菌ATCC49619购自中国药品生物制品检定所，其余菌株为本室临床分离。
1.1.2 药品 克林霉素（含量87.9%、批号2003122702）南阳普康集团化学制药厂生产、泰乐菌素（含量940IU/mg、批号0307168）山东鲁抗医药集团生产、庆大霉素（含量627IU/mg、批号2003032802）南阳普康集团化学制药厂生产、环丙沙星（含量98.9%、批号20040107）河南大明实业有限公司动物药品厂生产、氧氟沙星（含量98.5%、批号20040306）浙江康裕制药有限公司生产、强力霉素（含量91%、批号K4-008）河南开封制药厂生产、恩诺沙星（含量98.9%、批号20040114）河南大明实业有限公司动物药品厂生产、氟哌酸（含量98.1%、批号021102）浙江新昌国邦化学工业有限公司生产、林可霉素（含量91.8%、批号20040816）安徽省皖北药业集团皖北制药厂生产、阿莫西林（含量96%、批号030815）海利来企业有限公司生产、青霉素（含量99.76%、批号20040612）石家庄药业集团生产、土霉素（含量98.4%、批号200410355）石家庄华曙制药厂生产。
1.1.3培养基 营养琼脂、营养肉汤培养基本实验室制作，绵羊鲜血琼脂培养基本实验室制作，M-H琼脂加5%牛血清为杭州天和试剂有限公司产品。
1.2 方法
1.2.1 病原菌的分离和鉴定
⑴细菌的分离培养 将病料接种于血清肉汤进行增菌培养，如果病料污染较严重，匹克增菌液增菌，然后再划线接种在血液琼脂平板上，于37℃温箱中培养18～24h，观察菌落的形态及溶血类型。取脓汁、炎性分泌物、渗出物等，制成涂片，进行革兰氏染色镜检。如为革兰氏阳性菌并呈链状排列时，即接种于血平板上，进行纯培养。
⑵ 链球菌的鉴定 链球菌是一种圆形的球菌，呈链状排列，革兰氏染色阳性。对培养条件要求较严格，在普通培养基中生长不良，在血清肉汤和在血清琼脂平板上生长良好，菌落为露珠状，圆形、隆起、半透明，在血琼脂上形成α、β或γ溶血。生化实验40%、10%胆汁管较生理盐水管混浊，阴性。能发酵水杨苷、乳糖、山梨醇、淀粉，产酸不产气。不分解七叶苷、甘露醇、菊糖、棉实糖、马尿酸钠、海藻糖。血清肉汤轻微浑浊，管底形成粘性沉淀。过氧化氢酶试验阴性。
⑶ 链球菌分群试剂盒检验 将纯培养物接种于血清肉汤，于37℃温箱中培养18～24h，送锦州医学院第一附属医院检验处检验，采用法国生物—梅里埃公司生产的链球菌分群试剂盒（胶乳凝集法试验）检验。
1.2.2 测链球菌的MIC
⑴ 抗菌药物 将实验用药品制成1280μg/mL原液，分装成每瓶5mL，置于低温冰箱中，备两周内用，实验当日取出，用后废弃。
⑵ 菌液稀释 取鉴定后的纯培养物接种于5mL的血清肉汤中，经37℃培养16h的菌液保存于4℃，取一定量的菌液制成0.5麦氏比浊度菌液稀释10倍。
⑶平皿二倍稀释法测MIC 将一定量的药物原液加入到平皿中，再加入5%牛血清，然后向平皿中注入M-H培养基，待琼脂凝固后，将1～2mL菌液（相当于104CFU）接种于琼脂表面，用曲玻棒涂开，形成5～8mm的菌液圈，接种后置于35℃下孵育24h。
⑷ 判定标准[1] 采用平皿二倍稀释法测定各菌株对上述12种药品的最低抑菌浓度（MIC），结果按美国临床检验标准委员会（NCCLS）的标准判断。
3 结果
3.1 病原菌分离鉴定结果 共分离出27株目的菌。经培养特性和生化试验鉴定，27株均为C群马链球菌。细菌的生化鉴定结果见表1。链球菌分群试剂盒检验，27株均为C群马链球菌。
表1 细菌的生化鉴定结果
菌株号
1
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8
9
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11
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溶血性
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菊糖
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甘露醇
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