猪流感分子流行病学及免疫预防研究进展
发布: 2013-09-29 | 作者: 段廷云等 | 来源: 互联网
摘 要：猪流感是世界性流行的呼吸系统传染病之一,当与其它病原混合感染时会造成更严重的损害。它的免疫机制主要为黏膜免疫和体液免疫,滴鼻和肌肉注射都能产生高效的免疫应答。当前流行的猪流感病毒亚型主要为H1N1、H1N2和H3N2，常用的疫苗都是灭活苗。因为猪流感病毒亚型较多、抗原易发生变异和可在种间传播,给流感疾病的预防乃至人类的健康带来很多挑战。核酸疫苗、合成肽苗和基因工程苗的研究为猪流感的预防提供了广阔前景。
关键词：猪流感病毒；抗原漂移；免疫
猪流感是世界上最常见的猪传染病之一，传播迅速,常引起急性呼吸道疾病暴发。其典型的临床症状为流鼻涕、咳嗽和呼吸困难,伴有发热、嗜睡以及随之而来的厌食和消瘦等症状。因为在单独感染的情况下很少引起死亡,所以在国内并没有引起足够的重视,使用猪流感病毒（Swine influenza virus, SIV）疫苗进行免疫的猪场为数甚少。然而，SIV与猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive respiratory syndrome virus, PRRSV)、圆环病毒及肺炎支原体混合感染时，会显著增加上述疾病的损害程度和病死率。另外, SIV也是猪呼吸道疾病综合征(Porcine respiratory disease complex，PRDC)的主要病原。SIV与其它病原体共感染或继发感染所造成的损害已成为制约猪场经济效益的主要原因之一。由于猪流感在禽流感和人流感流行、传播和分子变异中的特殊作用,它对公共卫生也有着十分重要的意义。
1 猪流感病毒的主要亚型
1.1 流感病毒亚型分类的主要依据
SIV是正黏病毒科流感病毒属中A型流感病毒的成员，其基因组为8个片段的单链副股RNA。其中片段5编码主要的结构蛋白——核衣壳蛋白（Nucleocapsidprotein,NP），它的主要功能是与病毒RNA形成RNP复合体,以此来稳定病毒RNA，使其免受RNA酶的降解作用。NP具有良好的抗原性且不易变异,因此,根据NP抗原性的不同,可将流感病毒区分为A、B、C 3型。虽然A型SIV的NP基因核苷酸序列与其它型的显著不同(同源率为60%)，但SIV的不同毒株之间却表现为高度保守(同源率可达90％)。因此，以NP基因为模板的RT-PCR可特异性地用于A型SIV的检测。SIV的RNA片段4和片段6分别编码血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA）,它们是流感病毒亚型分类的依据。目前已发现的流感病毒HA亚型有15个，NA亚型有9个[1]。尽管不同的亚型之间可以组成很多种流感病毒血清型。但目前造成世界性流行SIV血清型只有H1N1，H1N2和H3N2。也有其它血清型的零星报道,如英国的H1N7[2]，美国的H4N6[3],中国的H9N2[4]和H5N1[5]等,但都没有造成大规模的流行。
1.2 猪流感在国内外流行的历史和现状
猪流感自1918年在美国首次发生以来,已造成世界范围内的多次大流行。SIV于1931年由Shope首次分离并鉴定,这就是20世纪初引起美国猪流感流行的古典型H1N1病毒株。与美国不同的是,欧洲大陆猪流感发生较晚,直到20世纪70年代末才出现暴发式流行,其流行的毒株虽然也是H1N1,但是与美国流行的古典型SIV在抗原性和遗传性上均有显著差异,而与来自鸭的H1N1有着很高的同源性。为了区别2种不同的H1N1毒株,通常把后者称为类禽型H1N1。这2种H1N1随后都传入亚洲等世界各国并长期流行。1969年H3N2亚型SIV首次被分离于台湾, 1970年在香港也分离到SIV的H3N2亚型毒株。这次流行的H3N2毒株及其变异株在以后的十多年间传播到了世界各地。1984年，欧洲大陆首次报道了类人H3N2亚型毒株引起的猪流感暴发，并且整个欧洲大陆的猪群都表现高水平的抗体。1988年，美国许多接种了H1N1流感疫苗的猪场暴发严重的猪流感，其病原经鉴定为H3N2亚型毒株。此后, H1N1和H3N2成为世界各国广泛流行的2个SIV主要血清型[6]。研究表明,近几年发生于日本、韩国、美国的H1N2亚型SIV是H1N1和H3N2的重组产物,因为H1N1和H3N2疫苗的双重免疫猪对H1N2亚型SIV感染具有交叉保护作用[7]。我国猪流感的血清学和病原学调查结果都表明,在我国横跨南北的多个省市都有严重的猪流感流行,其主要亚型是H1N1和H3N2[8-10]。值得注意的是这些流行病学调查是建立在猪场发生典型流感的基础之上,而近年来猪流感越来越朝着多病原混合感染的方向发展。当SIV与猪蓝耳病病毒、胸膜肺炎放线杆菌、肺炎支原体等混合感染时,其危害性会显著增加，死亡率显著增高[11-13]。
2 猪流感病毒宿主特异性及其变异
2.1 流感病毒宿主特异性的分子生物学基础
种间传播是SIV的显著特点之一。在流感病毒的感染过程中,HA起识别和吸附细胞受体的作用，它是宿主特异性的主要决定因素。不同动物气管黏膜上的细胞受体与HA分子上的受体结合位点特异性结合,不同种类流感病毒的HA具有不同唾液酸酶分子结构,结合不同的唾液酸受体,但这种结合又具有交叉性。禽流感病毒和马流感病毒的受体为唾液酸α2,3-半乳糖苷,人流感病毒的受体为唾液酸α2,6-半乳糖苷,而猪流感病毒对这2种受体都具有亲和性,猪的呼吸道黏膜上也同时具有这2种受体[14]。也就是说猪也能够感染人、禽、马流感病毒,猪流感病毒也能感染上述动物。当然,流感病毒的吸附和感染还需要宿主细胞膜表面糖蛋白及其它因素的参与[15]。人类1918年的西班牙流感、1957年的亚洲流感和1968年的香港流感都与当时的猪流感发生有着密切的关系。越南、泰国最近报道有多人死于禽流感病毒感染,在从禽到人的传播过程中是否有猪的参与尚无定论,所幸的是至今还没有发现动物流感病毒在人之间相互传播的证据。所以,猪流感不仅制约猪场经济效益,对整个养殖业乃至人类的健康都具有严重威胁。
2.2 猪流感病毒的遗传变异。
抗原变异快速是流感病毒的又一显著特点。HA、NA位于病毒囊膜的表面,是变异率最高的抗原蛋白质。流感病毒的抗原变异包括抗原漂移和抗原转变。抗原转变变异的幅度较大,常导致新亚型的产生。A型流感病毒有8个基因组片段,当2个或2个以上的不同病毒粒子同时感染1个宿主细胞时,在病毒的增殖过程中,不同病毒粒子的8个基因组片段可以随机相互交换，重组产生1个新亚型的流感病毒。因此,同1个亚型的不同株之间可能存在着较大的抗原性差异。流行于北美的H3N2型SIV就是1个包含有人、猪、禽3种流感病毒基因片段的重组子[16]；流行于日本的H1N2猪流感病毒是类禽型HA和人流感病毒的NA重组而成[17]。HA、NA还可以因自发的点突变而引起小幅度的变异,我们称之为抗原漂移。发生抗原漂移的原因是合成流感病毒RNA所需要的RNA聚合酶缺乏校正功能,病毒复制过程中核苷酸的点突变可能引起它所编码的氨基酸变异,当氨基酸变异达到一定程度时,就导致了抗原决定簇的改变,即抗原性发生变化。SIV的抗原变异能够帮助其逃脱宿主已建立的免疫,给猪流感的预防带来更大的困难。对世界各地分离的不同毒株的核苷酸测序,借助生物软件来分析这些毒株之间的谱系及遗传变异关系,是当今对猪流感病毒进行研究的热点之一。
3 猪流感的免疫机制及预防
3.1 猪流感的免疫机制
猪流感以黏膜免疫和体液免疫为主, T细胞也以一定的方式参与其中。呼吸道是SIV感染的主要途径,所以黏膜免疫对猪流感的预防至关重要。黏膜免疫系统是体内相对独立的免疫体系,在动物的支气管内存在着集合淋巴小结、弥散免疫细胞及树突状细胞,能够完成抗原递呈及免疫应答等一系列免疫反应。黏膜上皮内的淋巴细胞包括了M细胞、B细胞、T细胞及其它免疫细胞。M细胞是一种扁平上皮细胞, SIV与M细胞的细胞膜结合后,进入到细胞浆形成吞饮小泡而被消化，然后将抗原表位传送到下层的淋巴组织中,产生免疫应答[18]。SIV还能被另一种黏膜上皮细胞——抗原递呈上皮细胞所吸收,经MHCⅡ方式完成抗原递呈,并在CD4+T细胞的参与下诱导B细胞产生特异性抗体[19],黏膜中B细胞产生的免疫球蛋白以IgA为主。肌肉注射接种也能诱导机体产生高水平的体液免疫应答,保护机体免于肺组织损伤,但一般不能提高呼吸道黏膜中IgA的效价[20]。
3.2 猪流感疫苗
长期以来猪流感的免疫在世界各国都没有引起足够的重视,然而到了20世纪90年代中期,猪呼吸道疾病综合征的发生和流行改变了这一事实。PRRS和PRDC的发生给许多猪场造成了严重的损失,各国广泛开始了SIV疫苗的研究和应用。目前市场上使用的SIV疫苗都是灭活苗,有单价苗和H1N1与H3N2双价苗。为了得到长期持续的免疫效果,国内外的许多科研机构都在进行猪流感基因工程苗的研究。研究发现H3N2的HA中第92位～105位,127位～133位和183位～195位氨基酸是有效的抗原表位,利用这３段抗原表位的重复序列制备的合成肽疫苗免疫小鼠和家兔,都得到了高效价的抗血清,并且能够抑制SIV在MDCK细胞系上的蚀斑形成[21]。用腺病毒作载体表达HA、NP的基因工程苗也已构建成功, 能快速促进机体产生免疫,对３周龄以内的仔猪有很好的保护作用,这种疫苗特别适用于缺乏母源抗体保护的仔猪[22]。脂质体包囊的编码HA的DNA疫苗经呼吸道接种时, 能够诱导IgA、IgG体液应答,而且增加气管内IgA效价[20]。为了强化疫苗的免疫效果,应该在疫苗中加入一定的免疫佐剂。IL-1能加强IgM应答和CD4+ T细胞的增殖,缓解SIV感染的肺部急性炎症、增加病畜的存活率[23]。以干扰素为黏膜佐剂时SIV疫苗不仅能够提供长期持续的特异性免疫,还能增加鼻黏膜层内巨噬细胞的比例,这可能是I型干扰素所表现的一种新的作用机制[24]。当今世界流行的SIV主要以H1N1和H3N2为主,在许多地方H1N2作为一个新亚型也时有发生。同时用这2个亚型的疫苗免疫猪群对H1N2亚型SIV感染有交叉保护作用[25]。小猪呼吸道疾病综合征通常发生在14周龄～17周龄,我们习惯上称为18周龄墙。为了使猪群保持均一、整齐的抗体水平,通过母源抗体获得保护不失为一种有效途径。
关键词：猪流感病毒；抗原漂移；免疫
猪流感是世界上最常见的猪传染病之一，传播迅速,常引起急性呼吸道疾病暴发。其典型的临床症状为流鼻涕、咳嗽和呼吸困难,伴有发热、嗜睡以及随之而来的厌食和消瘦等症状。因为在单独感染的情况下很少引起死亡,所以在国内并没有引起足够的重视,使用猪流感病毒（Swine influenza virus, SIV）疫苗进行免疫的猪场为数甚少。然而，SIV与猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive respiratory syndrome virus, PRRSV)、圆环病毒及肺炎支原体混合感染时，会显著增加上述疾病的损害程度和病死率。另外, SIV也是猪呼吸道疾病综合征(Porcine respiratory disease complex，PRDC)的主要病原。SIV与其它病原体共感染或继发感染所造成的损害已成为制约猪场经济效益的主要原因之一。由于猪流感在禽流感和人流感流行、传播和分子变异中的特殊作用,它对公共卫生也有着十分重要的意义。
1 猪流感病毒的主要亚型
1.1 流感病毒亚型分类的主要依据
SIV是正黏病毒科流感病毒属中A型流感病毒的成员，其基因组为8个片段的单链副股RNA。其中片段5编码主要的结构蛋白——核衣壳蛋白（Nucleocapsidprotein,NP），它的主要功能是与病毒RNA形成RNP复合体,以此来稳定病毒RNA，使其免受RNA酶的降解作用。NP具有良好的抗原性且不易变异,因此,根据NP抗原性的不同,可将流感病毒区分为A、B、C 3型。虽然A型SIV的NP基因核苷酸序列与其它型的显著不同(同源率为60%)，但SIV的不同毒株之间却表现为高度保守(同源率可达90％)。因此，以NP基因为模板的RT-PCR可特异性地用于A型SIV的检测。SIV的RNA片段4和片段6分别编码血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA）,它们是流感病毒亚型分类的依据。目前已发现的流感病毒HA亚型有15个，NA亚型有9个[1]。尽管不同的亚型之间可以组成很多种流感病毒血清型。但目前造成世界性流行SIV血清型只有H1N1，H1N2和H3N2。也有其它血清型的零星报道,如英国的H1N7[2]，美国的H4N6[3],中国的H9N2[4]和H5N1[5]等,但都没有造成大规模的流行。
1.2 猪流感在国内外流行的历史和现状
猪流感自1918年在美国首次发生以来,已造成世界范围内的多次大流行。SIV于1931年由Shope首次分离并鉴定,这就是20世纪初引起美国猪流感流行的古典型H1N1病毒株。与美国不同的是,欧洲大陆猪流感发生较晚,直到20世纪70年代末才出现暴发式流行,其流行的毒株虽然也是H1N1,但是与美国流行的古典型SIV在抗原性和遗传性上均有显著差异,而与来自鸭的H1N1有着很高的同源性。为了区别2种不同的H1N1毒株,通常把后者称为类禽型H1N1。这2种H1N1随后都传入亚洲等世界各国并长期流行。1969年H3N2亚型SIV首次被分离于台湾, 1970年在香港也分离到SIV的H3N2亚型毒株。这次流行的H3N2毒株及其变异株在以后的十多年间传播到了世界各地。1984年，欧洲大陆首次报道了类人H3N2亚型毒株引起的猪流感暴发，并且整个欧洲大陆的猪群都表现高水平的抗体。1988年，美国许多接种了H1N1流感疫苗的猪场暴发严重的猪流感，其病原经鉴定为H3N2亚型毒株。此后, H1N1和H3N2成为世界各国广泛流行的2个SIV主要血清型[6]。研究表明,近几年发生于日本、韩国、美国的H1N2亚型SIV是H1N1和H3N2的重组产物,因为H1N1和H3N2疫苗的双重免疫猪对H1N2亚型SIV感染具有交叉保护作用[7]。我国猪流感的血清学和病原学调查结果都表明,在我国横跨南北的多个省市都有严重的猪流感流行,其主要亚型是H1N1和H3N2[8-10]。值得注意的是这些流行病学调查是建立在猪场发生典型流感的基础之上,而近年来猪流感越来越朝着多病原混合感染的方向发展。当SIV与猪蓝耳病病毒、胸膜肺炎放线杆菌、肺炎支原体等混合感染时,其危害性会显著增加，死亡率显著增高[11-13]。
2 猪流感病毒宿主特异性及其变异
2.1 流感病毒宿主特异性的分子生物学基础
种间传播是SIV的显著特点之一。在流感病毒的感染过程中,HA起识别和吸附细胞受体的作用，它是宿主特异性的主要决定因素。不同动物气管黏膜上的细胞受体与HA分子上的受体结合位点特异性结合,不同种类流感病毒的HA具有不同唾液酸酶分子结构,结合不同的唾液酸受体,但这种结合又具有交叉性。禽流感病毒和马流感病毒的受体为唾液酸α2,3-半乳糖苷,人流感病毒的受体为唾液酸α2,6-半乳糖苷,而猪流感病毒对这2种受体都具有亲和性,猪的呼吸道黏膜上也同时具有这2种受体[14]。也就是说猪也能够感染人、禽、马流感病毒,猪流感病毒也能感染上述动物。当然,流感病毒的吸附和感染还需要宿主细胞膜表面糖蛋白及其它因素的参与[15]。人类1918年的西班牙流感、1957年的亚洲流感和1968年的香港流感都与当时的猪流感发生有着密切的关系。越南、泰国最近报道有多人死于禽流感病毒感染,在从禽到人的传播过程中是否有猪的参与尚无定论,所幸的是至今还没有发现动物流感病毒在人之间相互传播的证据。所以,猪流感不仅制约猪场经济效益,对整个养殖业乃至人类的健康都具有严重威胁。
2.2 猪流感病毒的遗传变异。
抗原变异快速是流感病毒的又一显著特点。HA、NA位于病毒囊膜的表面,是变异率最高的抗原蛋白质。流感病毒的抗原变异包括抗原漂移和抗原转变。抗原转变变异的幅度较大,常导致新亚型的产生。A型流感病毒有8个基因组片段,当2个或2个以上的不同病毒粒子同时感染1个宿主细胞时,在病毒的增殖过程中,不同病毒粒子的8个基因组片段可以随机相互交换，重组产生1个新亚型的流感病毒。因此,同1个亚型的不同株之间可能存在着较大的抗原性差异。流行于北美的H3N2型SIV就是1个包含有人、猪、禽3种流感病毒基因片段的重组子[16]；流行于日本的H1N2猪流感病毒是类禽型HA和人流感病毒的NA重组而成[17]。HA、NA还可以因自发的点突变而引起小幅度的变异,我们称之为抗原漂移。发生抗原漂移的原因是合成流感病毒RNA所需要的RNA聚合酶缺乏校正功能,病毒复制过程中核苷酸的点突变可能引起它所编码的氨基酸变异,当氨基酸变异达到一定程度时,就导致了抗原决定簇的改变,即抗原性发生变化。SIV的抗原变异能够帮助其逃脱宿主已建立的免疫,给猪流感的预防带来更大的困难。对世界各地分离的不同毒株的核苷酸测序,借助生物软件来分析这些毒株之间的谱系及遗传变异关系,是当今对猪流感病毒进行研究的热点之一。
3 猪流感的免疫机制及预防
3.1 猪流感的免疫机制
猪流感以黏膜免疫和体液免疫为主, T细胞也以一定的方式参与其中。呼吸道是SIV感染的主要途径,所以黏膜免疫对猪流感的预防至关重要。黏膜免疫系统是体内相对独立的免疫体系,在动物的支气管内存在着集合淋巴小结、弥散免疫细胞及树突状细胞,能够完成抗原递呈及免疫应答等一系列免疫反应。黏膜上皮内的淋巴细胞包括了M细胞、B细胞、T细胞及其它免疫细胞。M细胞是一种扁平上皮细胞, SIV与M细胞的细胞膜结合后,进入到细胞浆形成吞饮小泡而被消化，然后将抗原表位传送到下层的淋巴组织中,产生免疫应答[18]。SIV还能被另一种黏膜上皮细胞——抗原递呈上皮细胞所吸收,经MHCⅡ方式完成抗原递呈,并在CD4+T细胞的参与下诱导B细胞产生特异性抗体[19],黏膜中B细胞产生的免疫球蛋白以IgA为主。肌肉注射接种也能诱导机体产生高水平的体液免疫应答,保护机体免于肺组织损伤,但一般不能提高呼吸道黏膜中IgA的效价[20]。
3.2 猪流感疫苗
长期以来猪流感的免疫在世界各国都没有引起足够的重视,然而到了20世纪90年代中期,猪呼吸道疾病综合征的发生和流行改变了这一事实。PRRS和PRDC的发生给许多猪场造成了严重的损失,各国广泛开始了SIV疫苗的研究和应用。目前市场上使用的SIV疫苗都是灭活苗,有单价苗和H1N1与H3N2双价苗。为了得到长期持续的免疫效果,国内外的许多科研机构都在进行猪流感基因工程苗的研究。研究发现H3N2的HA中第92位～105位,127位～133位和183位～195位氨基酸是有效的抗原表位,利用这３段抗原表位的重复序列制备的合成肽疫苗免疫小鼠和家兔,都得到了高效价的抗血清,并且能够抑制SIV在MDCK细胞系上的蚀斑形成[21]。用腺病毒作载体表达HA、NP的基因工程苗也已构建成功, 能快速促进机体产生免疫,对３周龄以内的仔猪有很好的保护作用,这种疫苗特别适用于缺乏母源抗体保护的仔猪[22]。脂质体包囊的编码HA的DNA疫苗经呼吸道接种时, 能够诱导IgA、IgG体液应答,而且增加气管内IgA效价[20]。为了强化疫苗的免疫效果,应该在疫苗中加入一定的免疫佐剂。IL-1能加强IgM应答和CD4+ T细胞的增殖,缓解SIV感染的肺部急性炎症、增加病畜的存活率[23]。以干扰素为黏膜佐剂时SIV疫苗不仅能够提供长期持续的特异性免疫,还能增加鼻黏膜层内巨噬细胞的比例,这可能是I型干扰素所表现的一种新的作用机制[24]。当今世界流行的SIV主要以H1N1和H3N2为主,在许多地方H1N2作为一个新亚型也时有发生。同时用这2个亚型的疫苗免疫猪群对H1N2亚型SIV感染有交叉保护作用[25]。小猪呼吸道疾病综合征通常发生在14周龄～17周龄,我们习惯上称为18周龄墙。为了使猪群保持均一、整齐的抗体水平,通过母源抗体获得保护不失为一种有效途径。
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