鸡β防御素1基因（Gal1）在大肠杆菌中的融合表达与纯化
发布: 2010-04-03 | 作者: 张辉华，毕英佐等 | 来源: 《中国兽医杂志》
（1.华南农业大学动物科技学院, 广东 广州 510642; 2佛山科学技术学院生命科学院,广东佛山 528231)
摘要： 内源性抗菌多肽防御素是机体先天性免疫系统的重要组成部分，可帮助机体防御外界病原微生物的入侵。鸡β防御素1（Gallinacin1，Gal1）对许多致病菌都具有杀菌作用，具有很好的研究开发价值。本研究利用PCR技术从重组质粒pGEM-T Easy Gal1中克隆出Gal1基因成熟肽区，将该基因插入原核表达载体pET32a(+)中，构建重组质粒pET32a(+)Gal1，然后用重组质粒转化大肠杆菌BL21。挑选阳性克隆菌，用浓度为0.5 mmol/L的IPTG进行诱导表达。SDSPAGE电泳显示在目标位置约25kD处出现了条带并用Werstern Blot进行了鉴定。表明Gal1基因在大肠杆菌以融合形式得到了表达。经灰度扫描显示重组蛋白表达量占细菌总蛋白的15.54%。用50%NiNTA纯化树脂进行层析纯化，在洗脱液E中出现单一条带。Gal1多肽在pET32a(+)质粒表达体系中成功表达为鸡防御素多肽下一步的研究奠定基础。
关键词： 鸡防御素1（Gal1）；融合表达；蛋白纯化
由于鸡体天然防御素含量低，直接提取远不能满足需要，且成本高、得率低、工序繁；化学合成可行但成本太高，应用受到局限；随着基因工程技术的发展，通过基因重组技术生产防御素多肽，以满足研究和生产的需要成为可能。因此构建一个表达高效、易于纯化的表达体系以制备大量的防御素多肽成为必需。大肠杆菌因其遗传背景最清晰、培养方便、周期短、成本低廉而备受人们的青睐，是目前应用最为广泛的外源基因表达宿主菌，很多抗菌多肽通过融合形式在大肠杆菌表达体系中得到表达，并经处理后产生抗菌活性。本研究将鸡防御素Gal1基因重组到pET32a(+)表达质粒中，对其以融合蛋白形式在大肠杆
菌BL21表达菌株中的表达作一研究。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株与质粒 大肠杆菌BL21、质粒pET32a(+)为华南农大动科院基因工程室保存；pGEMT Easygal1为华南农大动科院基因工程室构建。
1.1.2 主要试剂与工具酶 限制性内切酶、T4DNA连接酶、ExTaq酶均为TaKaLa产品；IPTG为Sigma公司产品；质粒抽提试剂盒为Omega公司产品。兔抗鸡IgY(二抗) 购自珠海百奥生物技术有限公司; 抗6个组氨酸抗体，预染色的蛋白质分子量标准为BioRad产品;硝酸纤维素膜购自基因公司。
1.1.3 蛋白纯化系统 NiNTA纯化树脂为基因公司产品。
1.2 方法
1.2.1 引物设计 根据Gal1cDNA序列和PCR引物的设计原则，并借助计算机软件DNA Star进行辅助分析，设计了1对PCR引物。上游引物（Primer1）：5′-ATGGATCC GGAAGGAAGTCAG
ATTG-3′；下游引物（Primer2）：5′-AT GAATTC T CAGCCCCATATTCTTTTGC-3′。引物由上海博亚公司合成。用于扩增Gal1成熟肽段，含40个氨基酸残基。Primer1的5′端含有BamHⅠ酶切位点；Primer2的5′端含有EcoR Ⅰ酶切位点及终止密码子TGA。
1.2.2 质粒构建 为了定向克隆Gal1基因成熟肽区，在所设计的引物两端分别加入Bam
HⅠ、EcoRⅠ酶切位点。利用PCR技术从重组质粒pGEMT Easygal1中扩增Gal1基因成熟肽段核苷酸，通过BamHⅠ与EcoRⅠ两种限制性内切酶酶切与同样双酶切的质粒pET 32a(+)进行连接，从而构建重组表达质粒pET32a(+)gal1。用该重组质粒转化感受态细胞BL21,用含氨苄青霉素的LB平板筛选阳性克隆挑选阳性克隆过夜培养，提取质粒DNA送去测序。
1.2.3 DNA序列测定 用Omega公司质粒抽提试剂盒抽提质粒，送上海博亚公司测序。
1.2.4 融合蛋白的表达与SDSPAGE检测 挑选测序正确并且读码框正确的阳性克隆接种到3 ml LA培养基试管中37℃过夜培养。第２天按2%的接种量接种到新鲜LA培养液中，待培养液OD600值达到0.5～0.6时加入IPTG进行诱导（终浓度为0.5 mmol），37℃继续培养4 h。诱导结束后立即12 000 r/min，4℃，离心2 min。沉淀加100 μl 1×SDS上样缓冲液，80℃反复冻融3次，用于SDSPAGE电泳。以pET32a(+)质粒按同样方法进行转化、诱导表达，取3 h诱导表达产物作为对照。
1.2.5 表达产物的纯化与Western Blot 将表达的产物离心获得菌体，加入PBS，冰浴超声10次，每次3 s，间隔5 s，功率400 W。结束后12 000 r/min，4℃，离心2 min，获得包涵体。包涵体用裂解液裂解至澄清透明。用NiNTA纯化树脂进行层析纯化。收集层析过程中的洗脱液，进行SDSPAGE电泳。成胶浓度为4%，分离胶浓度为12%。Western Blot操作参照《分子克隆》中的方法进行。
2 结果与分析
2.1 重组质粒pET32a(+)Gal1的构建 目的基因以融合方式定向克隆在TrxTag与Hi
sTag后面，以利于表达和纯化。同时在目的基因前面含有肠激酶酶切位点，可以用来裂解融合表达蛋白，生产重组Gal1防御素多肽。见图1。
图1 重组质粒pET32a(+)gal1构建示意图 （略）
2.2 Gal1基因的测序 将构建成的pET32a(+)gal1质粒进行测序，以便检查构建的质粒阅读框的正确。测序结果表明Gal1基因成熟肽段已成功的克隆到pET32a(+)质粒中，而且阅读框也正确（见图2）。
图2 pET32a(+)gal1重组质粒gal1部分核苷酸测序图(下划横线的为酶切位点)
2.3 融合蛋白的诱导表达 挑选阅读框正确的阳性工程菌进行诱导表达，在目标位置约25kDa处有一蛋白条带，空质粒对照组在约21 kDa处有一蛋白条带（为空质粒中TrxTag与His Tag等基因表达后产物，也即融合蛋白前面一段表达产物），表明Gal1基因在大肠杆菌BL21中以融合方式获得了表达，表达结果见图3所示。不同时间诱导表达结果见图4，经灰度扫描表明在诱导4 h表达量达到最大，占细菌总蛋白的15.54%。
图3 阳性菌落SDSPAGE图（略）
图4 不同诱导时间阳性菌落SDSPAGE图（略）
2.4 表达产物的纯化与Western blot 将收获的细菌经过变性洗脱，取各个阶段的洗脱液进行SDSPAGE检测，经过柱洗脱后可以看到在洗脱液E中出现有目的条带，结果如图5。Western Blot的结果见图6，在目标位置出现目的条带，表明目的蛋白与融合形式得到表达。
3 讨论
细菌耐药对现在临床用药是一个棘手问题。防御素作为一种肽类抗生素其穿膜作用机制不易使细菌产生耐药，可以很好地解决因细菌耐药造成的临床用药困难，因此生物机体内天然合成的抗菌活性多肽防御素被认为是一个好的抗生素替代者。再者防御素多肽属于生物机体内源性抗菌肽，不会有传统抗生素使用后带来的抗生素在动物机体内残留问题。此外除了具有抗菌活性特性外，防御素还可中和LPS、促进伤口愈合，对单核细胞的趋化性，调理作用活性，免疫增强活性，某些内分泌作用。同传统的抗生素还具有协同作用，几乎没有副作用。基于防御素的独特作用，有必要建立易于分离、纯化的防御素表达体系，为防御素多肽的生产的自动化、产业化奠定基础。防御素类多肽从理论上讲存在不利于原核表达的多种因素，但也有很多抗菌多肽及防御素多肽在大肠杆菌中成功表达并产生活性的报道。如李秀兰等将人工合成的抗菌肽CMIV基因，重组到表达载体pET28 (a) 上，抗菌肽以融合蛋白的形式表达。融合蛋白经镍离子亲和层析纯化后。再用CNB r裂解，最终产物具有与天然抗菌肽相同的生物学活性。庹晓晔〖FJJ〗等构建了pGEX4T1hBD3融合表达载体，转化E.coli DH5α宿主菌，IPTG诱导，获得了以包涵体形式存在的融合蛋白，经凝血酶处理释放出hBD3，并对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌产生抗菌活性。因此本研究开展了利用pET32a(+)质粒对Gal1基因成熟肽进行融合表达的研究。进行融合表达原因有4个: (1)可以提高异源蛋白质的稳定性。(2)可以提高外源基因在宿主细胞中的表达水平。(3)有利于目的蛋白的分离纯化。(4)可以避免直接表达时宿主菌的“自杀”。这四点对小分子抗菌多肽尤为重要。在目的蛋白（Gal1多肽）前面融合有TrxTag与His Tag，有助于融合蛋白的表达及纯化。本试验就是利用HisTag来进行目的蛋白纯化的。对融合蛋白可溶性分析表明，融合蛋白主要是以包涵体的形式存在。Gal1多肽在pET32a(+)质粒表达体系中表达量最多占到细菌总蛋白的15.54%，并不是很高，可能原因是在Gal1基因核苷酸密码子中有几个是大肠杆菌稀有的密码子，如AGG、AGA与GGA等密码子，从而影响了表达量，要提高表达量可以通过定点突变的方法进行。
图5 表达产物经NiNTA树脂层析纯化结果（略）
图6 表达产物Western blot图（略）
表达产物融合蛋白必须用肠激酶切去前面的融合肽段后,才能产生和天然成熟Gal1多肽相同长度的肽。对经纯化的融合表达蛋白进行透析复性、超滤、真空浓缩成粉末状后，用此蛋白进行抑菌试验不产生抗菌活性（对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌）（本论文数据没显示）。陈姗等用pQE80L表达质粒将人β防御素3在大肠杆菌中进行融合表达，不需要去掉融合肽段，融合表达产物对白色念珠菌、金黄色葡萄球菌与多重耐药金黄色葡萄球菌产生抗菌活性。是由于在其N端或C端融合的蛋白太大对其造成的影响，或者是由于基因不同、所用载体不同等原因产生的，有待于下一步的研究。
