仔猪大肠杆菌的分离鉴定及中药抑菌试验
发布: 2010-05-13 | 作者: 张雪梅，熊焕章，李晶 | 来源: 《中国兽医杂志》
（延边大学农学院动物医学系， 吉林 龙井 133400）
仔猪大肠杆菌病是由病原性大肠杆菌引起的一类多发性、致死性肠道传染病。因不同年龄、个体和生理机能的差异而呈不同的表现，常见的有仔猪黄痢、仔猪白痢和猪水肿病。该病是目前仔猪疾病群之一，也是导致仔猪死亡率高的主要原因之一，发病季节多集中于产仔旺季。仔猪自出生至断乳期均可发病，在1月龄内发病较多。目前用于防治仔猪大肠杆菌病的药物多为抗菌药，由于抗菌药在使用过程中，不仅杀灭了致病菌，而且也破坏了机体原有的正常菌群，导致微生态平衡的破坏，进而增加了机体对外源感染的敏感性，同时由于长期使用抗菌药，病原菌产生耐药性，收效甚微，此外长期使用造成的药物残留给动物和作为动物产品消费者的人类健康都带来了危害，为此，我们研制了中药肠安，为了验证中药肠安对大肠杆菌的抑菌效果，进行了大肠杆菌的分离鉴定，对分离菌株进行了抑菌试验的初步研究，旨在为该病的诊断、治疗和预防提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 病料的采集 无菌采取发病仔猪的粪便及其肠内容物各2份，每份约0.5 g。
1.1.2 培养基及试剂 麦康凯琼脂平板、普通琼脂平板、伊红美蓝琼脂平板、普通琼脂斜
面、肉汤培养基、三糖铁培养基、靛基质试剂、吲哚试剂等。
1.1.3 实验动物 健康昆明种小鼠10只，体重约20～25 g，由延边大学农学院小动物室提供。
1.1.4 受试药物 中药肠安，由延边大学农学院药理室自制。称取黄连120 g、当归100 g、黄芪50 g、乌梅50 g、陈皮50 g、甘草30 g，水煎，浓缩至1 ml中含原药1 g，灌装，压盖，灭菌，备用。
1.2 方法
1.2.1 大肠杆菌的分离培养 用稀释液10倍稀释病料，接种于普通琼脂培养基中，37℃培养24 h，观察菌落生长情况。在普通琼脂培养基上挑取圆形、整齐、隆起、湿润、光滑及灰白色的菌种分别划线接种于麦康凯琼脂培养基、伊红美蓝琼脂培养基和普通肉汤培养物、三
糖铁培养基中，37℃培养24 h，进行观察，同时将选取的菌落接种于普通琼脂斜面培养基，37℃培养24 h，以备生化试验及形态观察。
1.2.2 分离菌生化试验 对细菌进行糖类分解试验、吲哚试验、甲基红试验。
1.2.3 分离菌形态观察取麦康凯琼脂培养基上生长的红色菌落按常规方法涂片，革兰氏
染色，光学显微镜下观察。
1.2.4 动物致死性实验 经生化试验选出的大肠杆菌接种于普通肉汤培养物中，37℃培养24 h。取健康小鼠10只，随机分为试验组和对照组，每组5只，试验组腹腔注射培养液0.2 ml/只，对照组腹腔注射灭菌生理盐水0.2 ml/只，观察记录小鼠发病及死亡情况。
1.2.5 体外抑菌试验
1.2.5.1 纸片扩散法 将中药肠安分别稀释、浓缩成0.5 g/ml、1 g/ml、2 g/ml、4 g/ml的药液浓度，每种药液分别用灭菌纸片(直径6 mm)浸透，将含中药肠安的灭菌纸片平置于已均匀涂布好的大肠杆菌平板表面,置37℃培养24 h后取出，测量各纸片周围抑菌圈直径。
1.2.5.2 打孔灌药法以直径为6 mm无菌打孔器在普通琼脂平板上打孔5～6个，用无菌针头挑出孔内琼脂，每个孔分别加入0.5 g/ml、1 g/ml、2 g/ml、4 g/ml浓度的药液0.2 ml，然后将试验菌液均匀接种于洞口四周的琼脂上，37℃培养24 h，以抑菌圈直径评定药物的抑菌作用。
1.2.5.3 平皿法 药液按无菌法依次稀释2、4、8、16、32倍，即浓度分别为0.5 g/ml、0.25 g/ml、0.125 g/ml、0.063 g/ml和0.032 g/ml。将已稀释药液与普通营养琼脂培养基充分混匀，制成含药物的平板培养基，其含中药肠安的浓度分别为0.1 g/ml、0.05 g/ml、0.025 g/ml、0.012 5 g/ml、0.006 3 g/ml和0.003 2 g/ml。用接种环蘸取1∶1 000的大肠杆菌悬液，以划线接种于上述含药平板内，37℃培养24 h，观察细菌在不同浓度药物平板上的生长情况，细菌不生长的最低浓度即为该药物对该菌的最小抑菌浓度(MIC值)。
2 结果
2.1 培养特性 在普通琼脂平板上生长的菌落光滑、灰白、湿润、圆形、边缘整齐、稍有隆起；麦康凯琼脂平板上生长的菌落圆形、红色、边缘整齐；伊红美蓝琼脂平板上形成黑色带金属光泽的菌落；普通肉汤中可观察到肉汤变混浊，底部有絮状物沉淀。
2.2 生化特性 三糖铁试验中，培养液呈现黄色，并伴有气泡产生；吲哚试验中，培养液呈现红色；甲基红试验中，培养液呈现红色。生化试验结果符合大肠杆菌的特征。
2.3 形态特征 细菌涂片，革兰氏染色，光镜检查，可见该菌为两端略显钝圆的中等大小杆菌、散在或成对存在、两端着色较深、革兰氏染色阴性。
2.4 动物致死性实验 24 h内,试验组10只小鼠除2只发病未致死外，其余8只全部死亡，发病率达100%，致死率达80%，而对照组小鼠正常。由此证明本次分离的大肠杆菌为致病性大肠杆菌，并具有高致病性。
2.5.1 纸片扩散法和打孔灌药法试验结果 结果显示，中药肠安在0.5 g/ml、1 g/ml、2 g/ml、4 g/ml不同浓度时，通过纸片扩散法测得抑菌圈直径分别为7.5 mm、9.8 mm、14.0 mm、17.0 mm，经打孔灌药法测得抑菌圈直径分别为11.0 mm、13.3 mm、18.0 mm、20.0 mm，随着中药肠安浓度的增加,抑菌圈直径增大。说明中药肠安对仔猪大肠杆菌具有较强的抑制作用，并随药物浓度的增加而增强。
2.5.2 平皿法试验结果 平皿试验中，在0.0125 g/ml浓度中药肠安的平皿中可看到有细菌散在生长，而0.1 g/ml、0.05 g/ml、0.025 g/ml浓度的平皿中无细菌生长，因此确定中药肠安的最小抑菌浓度MIC值为0.025 g/ml，稀释度为1∶40。
3 小结与讨论
3.1 根据细菌形态特征、培养特性、生化特性及动物致病性试验，确定从发病仔猪的粪便、肠内容物中分离的细菌为致病性大肠杆菌。
3.2 动物致病性试验结果表明，分离的大肠杆菌致病性很强，使小鼠的发病率达100%，致死率达80%，这进一步为该病的诊断提供了可靠依据。
3.3 体外抑菌试验结果表明，中药肠安对仔猪致病性大肠杆菌具有较强的抑制作用，抑菌效果随着药液浓度的升高呈现高效性，其最小抑菌浓度MIC值为0.025 g/ml。从而为该病的治疗和预防提供了科学理论依据。
