猪圆环病毒2型GD株ORF2基因的序列分析
发布: 2010-04-03 | 作者: 宋长绪，赵亚华，蒋智勇 | 来源: 《中国兽医杂志》
摘要：
根据GenBank中猪圆环病毒2型（PCV2）ORF2基因序列，设计一对引物，应用PCR从本室鉴定分离的PCV2 GD株的细胞培养物中扩增出ORF2基因（702 bp）。将此基因片段克隆入pMD 18-T载体，筛选获得重组质粒pMD-ORF2并对其测序，结果表明所克隆的ORF2基因与其他PCV2的ORF2基因核苷酸序列同源性在92.1%～99.9%之间，推导的氨基酸序列同源性在90.2%～99.5%之间。
关键词： 猪圆环病毒2型(PCV2)； ORF2基因； 序列分析
猪圆环病毒(Porcine circovirus，PCV)与鸡贫血病毒(CAV)、鹦鹉喙羽病毒(PBFDV)和一些植物病毒同属于圆环病毒科（Circoviridae）成员。病毒粒子为20面体对称,以滚环方式进行复制，该病毒的基因组是一种环状、无囊膜、单链DNA。
根据PCV的致病性与核酸序列的不同，将猪圆环病毒分为PCV1和PCV2。PCV1广泛存在于猪源肾细胞中，但并不引起感染猪发病，其基因组为1 759 bp，包含7个读码框架。PCV2首先由Allan等从患断奶猪多系统衰弱综合征(PMWS)的猪群中分离到，被证明为PMWS的重要病原。目前在德国、法国、西班牙、加拿大、美国、日本、印度等国和中国已有检测到PCV2的相关报道。PCV2常和呼吸与繁殖障碍综合征病毒(PRRS)、细小病毒(PPV)、伪狂犬病病毒(PRV)混合感染，造成猪的免疫失败，给养猪业带来重大的经济损失。PCV2的基因组为1 768 bp。目前国外报道的PCV2基因组包含11个读码框架,推测分别编码2～36 kD的蛋白。PCV1、PCV2均包含有两个主要的读码框架，即ORF1和ORF2。二者的ORF1核苷酸和编码的蛋白质同源性分别为83%、86%,而ORF2分别为67%、65%。ORF1编码与病毒复制相关的Rep蛋白，此蛋白在两种病毒之间有85％的同源性，是PCV1、PCV2产生抗原交叉性的主
要原因；ORF2编码病毒的主要结构蛋白（核衣壳蛋白），此蛋白具有良好的免疫原性。
本研究旨在采用PCR方法克隆得到PCV2的ORF2基因，并对其进行序列分析，为该病毒的分子生物学、流行病学、致病机理等相关领域的研究奠定基础。
1 材料与方法
1.1 病毒、质粒和菌种 PCV2 GD株分离自广东省东莞某猪场的1份送检病料。pMD 18-T vector购自TaKaRa公司（大连）；宿主菌DH5α为本实验室保存。
1.2 试剂 PCR试剂盒、蛋白酶K、DNA片断回收试剂盒、质粒提取试剂盒购自TaKaRa公司（大连）。
1.3 引物
P1：5′-TTA GGT ACC CAT GAC GTA TCC AAG GAG-3′
P2：5′-TTA AAG CTT AGG GGT TAA GTG GGG-3′
为了方便克隆在引物P1中引入了KpnⅠ酶切位点，在引物P2中引入了HindⅢ酶切位点。引物由上海博亚生物技术有限公司合成。
1.4 模板的制备 取少量死亡猪组织病料充分研磨制成悬浮液，反复冻融3次，离心取上清，加入蛋白酶Ｋ至终浓度100 μg/ml、SDS至终浓度1％，55℃水浴2 h，用苯酚、苯酚∶氯仿（1∶1）、氯仿各抽提1次，吸取水相加入1/10体积的3 mol/L的NaAC及2倍体积的无水乙醇沉淀1 h，12000 r/min，4℃离心15 min，沉淀悬浮于超纯水中，取适量用作PCR模板。
1.5 ORF2基因的扩增及其克隆 用于PCR反应的引物浓度为10 ｐmol/Ｌ，整个反应体系50 μl，反应成分如下：Premix Taq（DNA Polymerase，Buffer，dNTP mixture），上下游引物各1 μl，模板DNA 4 μl，加去离子水至50 μl，均匀混合。在94℃变性2 min后，按94℃变性1 min，53℃退火1 min，72℃延伸1.5 min进行35个循环，最后72℃延伸10 min。反应结束后取5 μl PCR产物用1.
5％琼脂糖凝胶电泳分析。将PCR产物用TaKaRa公司DNA回收试剂盒回收，用常规方法与pMD 18-T载体进行连接；将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，37℃培养12 h,挑取上述转化平皿中的白色菌落，接种到含有Amp(100 μg/ml)的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜至混浊，提取质粒并进行酶切鉴定，筛选出阳性重组质粒。将阳性重组质粒送到博亚公司（上海）测序。
1.6 序列分析 将测序结果用Blast和DNAStar软件与GenBank中其他PCV2毒株ORF2基因的核苷酸及其编码的氨基酸进行同源性比较，并对ORF2多肽的抗原表位及其疏水性进行预测分析。
2 结果
2.1 ORF2基因的PCR扩增 PCR扩增产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳分析表明，扩增出了与ORF2相应的约720 bp大小的特异片段，与预期结果相符（图1略）。
2.2 重组质粒的筛选结果 PCV2 ORF2的重组质粒用EcoRⅠ酶切可得一条430 bp左右的片段。KpnⅠ和HindⅢ双酶切可切出一条约720 bp的片段（图2）。经过蓝白斑、酶切鉴定获得的含有PCV2 ORF2基因的重组质粒命名为pMD-ORF2。
图2 (略) 重组质粒pMD-ORF2的酶切鉴定
2.3 测序结果及核苷酸序列同源性分析 测序得知，克隆于pMD-ORF2基因长为 702 bp，与预期结果相符。将其与GenBank中的PCV2毒株的ORF2基因的核苷酸及其推导的氨基酸序列进行了同源性比较。序列分析结果显示，所有PCV（包括PCV1、PCV2）的ORF2基因长为702～705 bp，编码233～234个氨基酸。将所测序列与GenBank中的其他已知参考毒株ORF2基因进行比较。我们选择来自美洲、欧洲及
中国的17个代表毒株(4株PCV1，13株PCV2)，应用DNAstar分析软件对这些序列进行同源性分析发现，所有PCV2毒株ORF2基因之间核苷酸序列同源性均很高(表1)，介于92.2%～99.9%，推导的氨基酸序列同源性为90.2％～99.5％。PCV的变异区域主要位于ORF2基因内,为了更好地了解PCV毒株的遗传学特性及相互的亲缘关系，我们在分析所有ORF2基因同源性的基础上绘制了系统发生进化树(图3)。从中可以看出，PCV分成PCV1及PCV2两个完全独立的基因型。13株PCV2 ORF2基因密切相关，组成一独立分支；只有NC002068相距较远自成一分支。我国的AY556476 、AY556477两株间的ORF2基因编码234个氨基酸，相对独立自成一分支。
表1 ORF2基因序列比较 Percentldentity(略)
2.4 GD株ORF2基因编码的氨基酸抗原性和亲水性分析 测序结果表明PCV2 GD株ORF2基因长702 bp，编码233个氨基酸，其推导的氨基酸序列如图4所示，分子量大约为27.8 kD。该蛋白含有37个碱性氨基酸(K,R)，且有多处串联的碱性氨基
酸(R)；16个酸性氨基酸(D,E)；63个亲水性氨基酸(A,I，L,F,W,V)；72个极性氨基酸(N、C、Q、S、T、Y)。
利用DNAStar软件对ORF2蛋白的抗原表位预测，ORF2所编码的氨基酸在3～18位、34～42位、84～87位、114～118位、178～181位、227～231位可能存在抗原表位(图5)。对ORF2蛋白的亲水性分析表明，该蛋白具有较强的亲水性(图6)。
3 讨论 目前PCV2已经在世界范围内广泛存在，本研究所克隆的广东省东莞地区流行毒株的ORF2基因与其他PCV2毒株的ORF2基因核苷酸序列同源性介于92.2%～99.9%之间，由此可见所有PCV2毒株的核苷酸序列都有较高的同源性，说明PCV2毒株间的亲缘关系很近。在PCV2的11个阅读框中，研究较深入的是ORF1和ORF2，目前对ORF2的研究已成为PCV2研究的热点。Liu等用免疫荧光方法研究了PCV2 ORF2在细胞中的定位，发现ORF2蛋白N端41个氨基酸与PCV2在细胞核内定位有关。进一步分析表明第12个到第18个，第34个至第41个氨基酸域在定位中起着重要作用。Nawagitgul等认为ORF1编码蛋白与PCV的复制有关，而ORF2编码一种分子量为30 kD的结构蛋白，用杆状病毒表达ORF2基因发现，在电镜下能观察到ORF2蛋白可以自我装配成病毒衣壳样颗粒。Mahe等用杆状病毒和质粒载体表达了ORF1和ORF2，发现PCV1 ORF2虽与PCV2 ORF2抗原性相关，但只有ORF2蛋白可以被PCV2多抗识别。Liu等将ORF2基因连接到MBP-His(8)-tag基因3′端，在细菌中表达了ORF2融合蛋白，该融合蛋白可以与PCV2的多抗反应。这一结果表明可以用ORF2来区分PCV1与PCV2。也正是由于ORF2的以上特性，使其成为临床上在分子水平上诊断PCV的理想抗原。
