我国新发现猪丁型冠状病毒病
发布: 2015-11-07 | 作者: 佚名 | 来源: 网络
猪丁型冠状病毒又称猪德尔塔冠状病毒（PDCoV），是一种新发现的冠状病毒，它主要感染整段小肠，尤其是空肠和回肠，引起严重的肠炎并伴有小猪的腹泻和呕吐。2009—2010 年PDCoV 在中国香港首次报道该病毒。2014年初，在美国首次报道猪群该病的流行，此后至少有19个州有该新型冠状病毒的报道。在美国，猪丁型冠状病毒感染与猪流行性腹泻（PED）和猪传染性胃肠炎（TGE）的临床发病情况比较相似，但是发病症状相对较轻。新型猪肠道冠状病毒病可引起乳猪腹泻和呕吐，发病率和死亡率高达50% -100%，生长猪和成年猪感染后死亡率低。现将本次病例报告如下。
材料与方法
病料
来自华南某集约化猪场（2000头基础母猪）3～7日龄的乳猪5头，全场乳猪发生严重腹泻，传播迅速，发病率90%、死淘率90%以上。采集发病猪的小肠，按1：5研磨制备成病料，-80℃冻存待检。
主要试剂
RNA抽提试剂盒购于上海A公司，反转录酶、RNA 酶抑制剂、dNTP、18T载体克隆试剂盒、DL2000 DNA Marker、胶回收试剂盒、DH5α感受态细胞等购自TAKARA公司。
引物设计与合成
本实验室根据GenBank 所发布的序列号，选择N基因，运用Primer Premier5.0分别针对PDCoV、PEDV、TGEV、和RTV（猪轮状病毒）设计4对引物，由B公司合成，预计扩增的特异性基因片段大小为482 bp、450 bp、810 bp 和620 bp。
总RNA 的提取
病料经离心取上清液，按照ANYGEN 核酸提取试剂盒说明书提取病毒总RNA，然后用物RNA 酶的水溶解，放在-80℃保存。
RT-PCR 的检测
反转录体系：ddH2O 4 μL，下游引物R 1μL，RNA1μL，70 ℃水浴10 min 冰浴2 min ；5×MLV buffer 2μL，ddH2O 1μL，dNTPs 0.5μL，RNA 酶抑制剂 0.25μL，MLV 反转录酶 0.25μL，42 ℃水浴1 h，72 ℃水浴15 min冰浴至冷却。PCR 体系：ddH2O 32.5μL，10×MLV buffer 5μL，dNTPs 4μL，F 2μL，R2μL， cDNA 4μL，rTaq 0.5μL。反应条件为94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃30 s，30Cycles ，72 ℃ 7 min，PCR 反应产物于1.0% 琼脂糖凝胶电泳。
克隆
将阳性PCR 产物经纯化回收后与PMD-18T 载体连接，转化到大肠杆菌DH5α 感受态细胞中，培养后挑单个菌落进行PCR 鉴定，鉴定成功的重组质粒送往B公司进行测序。
序列分析
将RT-PCR 扩增获得的N 基因进行克隆、测序， 利用MEGA6 软件处理，与GenBank 上已公布的PDCoV 毒株的N 基因序列（表1）进行同源性比对分析，并绘制系统进化树。
结果与分析
病猪症状和病变
该集约化猪场5至15日龄乳猪发生传播迅速的严重腹泻，迅脱水死亡，死淘率高达90%以上。症状见剖检病变见图1和图2。主要在小肠,肠管明显扩张, 内充满黄色液体, 肠壁变薄、松弛、小肠黏膜充血, 肠系膜呈索状充血。
