杨 隽  黑龙江八一农垦大学动物科技学院，密山 158308

　　摘要：在叙述RFLP技术、DNA指纹技术、RAPD技术和AFLP技术的基础上，说明了分子遗传标记在家畜基因定位、基因图谱构建、背景基因型选择及杂交选育上的应用，并指出分子遗传标记应用于家畜育种需要解决的问题。

　　分子遗传标记技术的发展，为家畜育种高效而精确地选择目标基因型开辟了新道路，也使传统的育种工作跨上了新台阶。分子遗传标记是指受基因控制并可用于间接选择的各个性状;在育种方案中，分子遗传标记的关键作用在于可以使后代能够得到双亲的全部染色体片段。根据遗传标记进行选种可望识别具有优良基因的种畜个体，提高选择强度，缩短世代间隔，以获得最大遗传进展。

1、分子遗传标识的种类和特点

　　分子遗传标记是以物种突变造成DNA片段长度多态性为基础的，具有许多优点；（1）直接探测DNA水平的差异，不受时、空的限制;（2）标记数量丰富、多态性高;（3）共显性标识，可以区分纯合子与杂合子;（4）可以解释家系内某些个体的遗传变异;（5）可以鉴定不同性别、不同年龄的个体。随着基因工程特别是DNA重组技术的发展，现在人们已确知动物不但有毛色、体态、血型、染色体等的多态性，而且有DNA水平的多态性，特别是20世纪80年代以后，研究DNA多态性的各种遗传标记方法发展极其迅速，分子遗传标记应用于动物育种成为现实。应用较广泛的分子遗传标记有：限制性片段长度多态分析技术(Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP)、DNA指纹分析技术(DNA Fingerprint)、随机引物扩增多态性DNA技术(Random Amplified Polymorphism DNA，RAPD)和扩增片段长度多态性分析技术 (Amplified Fragment Length Polymorphism，AFLP)。

　　1.1 RFLP分析技术

　　20世纪70年代中期，遗传学家发现了RFLP现象;1980年Botstein首先提出利用RFLP作遗传标记构建遗传图谱，直到1987年Donis等人才构建出第一张人的RFLP图谱。RFLP基本原理是基因组DNA在限制性内切酶作用下，产生大小不等的DNA片段;它所代表的是基因组DNA酶切后产生的片段在长度上的差异，这种差异是由于突变增加或减少了某些内切酶位点造成的。RFLP作为遗传标记具有其独特性:（1）标记的等位基因间是共显性的，不受杂交方式制约，即与显隐性基因无关;（2）检测结果不受环境因素影响;（3）标记的非等位基因之间无基因互作效应，即标记之间无干扰。RFLP分析技术的主要缺陷是克隆可表现基因组DNA多态性的探针较为困难，但随着可标记多态性探针的增多，该技术将在分子生物学研究中得到更广泛的应用。

　　1.2 DNA指纹分析技术

　　20世纪80年代初期，人类遗传学家相继发现在人类基因组中存在高度变异的重复序列，并命名为小卫星DNA。它以一个基本序列(l1一60碱基对)串连排列，因重复次数不同而表现出长度上的差异。1987年人们利用人工合成的寡核苷酸(2~4碱基对)作探针，探测到高度变异位点，即所谓的微卫星DNA。以小卫星或微卫星DNA作探针，与多种限制性内切酶酶切片段杂交，所得个体特异性的杂交图谱，即为DNA指纹。DNA指纹技术作为一种遗传标记有以下特点:（1）具有高度特异性。同一物种两个随机个体的指纹相似系数仅为0.22，二者指纹完全相同的概率为三千亿分之一;(2)遗传方式简明。DNA指纹遵循孟德尔遗传定律，卫星DNA是高度变异的重复序列，所检测的多态性信息含量较高;（3）具有高效性。同一个卫星DNA探针可同时检测基因组中10个位点的变异，相当于数10个探针。由于卫星DNA不是单拷贝，难于跟踪分离群体中个体基因组中同源区域的分离。

　　1.3 RAPD分析技术

　　RAPD是Williams等人(1990)发展起来的一种新型遗传标记，尽管这一技术比较年轻，但由于其独特的检测DNA多态性的方式即极快速、简捷、高效等优点，使得RAPD技术已渗透于有关基因研究的各个领域。RAPD是建立于PCR基础之上的，利用随机的脱氧核节酸序列作引物(一般9~10碱基对)，对所研究的基因组DNA体外扩增，扩增产物经电泳分离染色后，来检测其多态性，这些扩增DNA片段多态性便反映了基因组相应区域的DNA多态性。RAPD标记特点是：（1）RAPD扩增引物没有物种的限制，一套引物可用于不同物种基因组分析;（2）RAPD扩增引物没有数量上限制，可以囊括基因组中所有位点;（3）RAPD技术简捷方便，可进行大量样品的筛选。RAPD标记是显性的，无法区分动物纯、杂合体，而且在分析中易产生非特异性。

　　1.4 AFLP分析技术

　　Zabean等(1993)将PCR与RFLP结合起来，创造了AFLP分析技术。基因组DNA先用限制性内切酶双酶切，再在两端连上特定的人工接头，根据接头和酶切位点的序列设计引物。一般在引物的3'端再增加1一3个碱基进行选择性扩增。不同样品由于DNA序列不同，扩增出的片段数及长度各不相同，经变性的聚丙烯酰胺电泳就能区分出不同样品之间的差异，作为遗传标记构建连锁图，或鉴定与特定性状连锁的标记。与RFLP比较，它无需了解DNA模板序列，产生的多态性较多;与RAPD比较，它的可重复性得到极大提高。Higuch从已灭绝的斑驴皮肌中提取DNA，经PCR扩增，进行斑驴与马的亲缘关系研究，取得成功。

2、遗传标记在家畜育种中的应用

　　2.1基因定位

　　RAPD快速寻找同一区域连锁DNA标记的方法，可为RFLP连锁间隔区提供新的DNA标记，或增加同一区域分子标记的密度比。由于RAPD能在一次反应中检测基因组的多个位点，因此它可迅速找到两组DNA样品间多态性差异，进而得到与此差异相连锁的DNA标记。RAPD基因定位方法主要有两种：（1）近等位基因系的定位。它是由提供靶基因的供体亲本与轮回亲本杂交、多次回交，通过每代对靶基因选择而获得的、除靶基因外，其它性状大部分与轮回亲本相同的品系；因此，它的基因组DNA除目的基因所在区域与轮回亲本不同外，余者基本相同，这样便为RAPD对两个基因组DNA进行多态性检测提供了可能，找出它们基因组扩增产物的差异，用这些有差异的产物做探针，再由RFLP连锁分析定位这些基因。（2）通过对目的基因有分离的F2进行基因定位。根据F2个体中的目的基因分离构建2个基因文库，然后从中分别随机抽取30个样本，分别提取其DNA，并等量混合，又形成2个新文库，这2个新文库对目的基因是选择性的，而对其它部分基因则是随机的;利用RAPD找出与目的基因区域相连锁的DNA多态性标记，从而定位该基因。

　　2.2构建基因图谱

　　基因图谱是遗传学研究的重要内容，也是家畜遗传育种的依据。分子遗传标记构建遗传图谱的原理与形态标记相同，不同的是一个分子遗传标记分离群体，可同时获得几十个乃至几百个标记;而且可以使用不同的分离群体(暂时性或永久性分离群体)。目前，已构建出牛、马、猪等家畜的RFLP遗传连锁基因图谱。

　　2.3背景基因型的选择

　　Hilel等(1990)认为，在回交群体中，可借助DNA指纹的辅助选择，从而接受或拒绝某一特定的基因组背景，这样有助于基因的导入，但微卫星标记应用于基因导入育种方案，并不具有完美的适应性。Groen等人 (1992)假设被导入基因已被定位，即可在后代中加以鉴定，而实际上是不可能的，而且被导入的QTLs与标记基因常常发生重组现象。Smith等 (1995)在Groen等研究成果的基础上，进一步研究在不同杂交方案中表型选择和标记辅助选择的效率，得出结论，利用标记选择的效果不如表型选择。

　　2.4杂交选育

　　根据分子标记位点的杂合性预测各组合之间的杂种优势，可极大地减少配合力测定工作。对杂交后代的鉴定和选择是育种工作的重要内容。在传统育种中，有些性状无法在早期鉴定筛选而被淘汰;如果利用这些性状连锁的分子标记进行辅助选择，不仅可以早期选择，而且能在短时间内对大量后代进行鉴定。大量研究均假设群体处于连锁不平衡状态，并均考虑最简单的情况一一两近交系间的杂交。通过杂种后代(F2)实施标记辅助选择，而后分两个阶段进行:(1)以标识一QTL连锁测验的估计值光标准选用标记，对此，一个重要问题是如何在群体中选择遗传标记，被选标记必须能够解释部分遗传为方差。从基因组所有遗传标记中选择某些较为理想的标记，再从新的独立样本群对标记效应的回归系统进行估计，这种情况下，标记的估计值是无偏的。(2)基于标识基因型和个体表型及其亲属表型进行个体选择。

　　分子标记为家畜育种开辟了一条新途径，但能否在育种实践中发挥应有的作用，取决于下面4个因素:(1)具有与目标基因紧密连锁的分子标记;(2)具有多态性高的分子标记绘制的遗传图谱;(3)能否实现分子标记分析自动化，降低成本，简化实验;(4)应用标记预测育种值的方法有所改进。这4个方面已取得较大的进展，随着生物技术的深入发展与完善，分子标记在家畜育种中将发挥越来越大的作用。