猪伪狂犬病诊断方法研究进展
发布: 2010-04-03 | 作者: 焦明，赵玉军等 | 来源: 《动物医学进展》|沈阳农业大学畜牧兽医学院，辽宁沈阳 110161
伪狂犬病(Pseudorabies，PR)由伪狂犬病毒(Pseudorabies virus，PRV)引起，最早发现于美国，因临床表现与狂犬病类似，故称伪狂犬病。该病在全球范围内的流行呈上升趋势，世界上已有50多个国家和地区报导该病的流行。我国自1947年刘永纯从猪体分离到PRV以来，已有24个省(市)、自治区报导流行[1]。文章主要对血清学、分子生物学诊断与检测方法以及鉴别诊断方法进行综述。
1 传统诊断方法
1.1 临床诊断和病理组织学检查
成年猪无明显症状，母猪流产或产死胎，仔猪表现神经症状，肌肉振颤，严重时四肢划水样运动，体温升高达41 ℃～42 ℃。取PR病例的脑和脊髓做成组织切片，苏木素-伊红染色后观察呈现非化脓性脑炎变化，其他大体剖检特征不明显。在神经细胞、胶质细胞和毛细血管内皮细胞可检出A型核内包涵体。
1.2 动物接种试验
将典型病例病料悬液给家兔、小鼠或鸡胚接种，观察其临床症状的出现从而确诊。家兔出现精神委顿，体温升高，继而注射部位出现奇痒症状，随即肌肉痉挛，角弓反张，最后死亡。小鼠接种后有奇痒症状，持续12 h，在2 d～5 d内死亡。鸡胚接种后3 d～4 d后，病毒侵害神经系统，鸡胚死亡[2]。
2 血清学诊断
2.1 中和试验
中和试验(serum neutralization test，SN)又称微量血清中和试验(mircoserum neutralization test，MSNT)，作为病毒检测的经典方法，是世界上多数国家检测PR的法定方法之一[3]。
方六荣等[4]用MSNT进行了PR的血清学调查。通过监测中和指数和中和效价，发现SNT的特异性很强，但敏感性较低。如果延长抗原与血清的孵育时间，尤以补体存在时，可使其敏感性增高。由于该法操作繁琐，工作量大，且受技术、细胞等条件限制，给实际应用带来一定的困难。
2.2 乳胶凝集试验
乳胶凝集试验(latex agglutination test，LAT)利用抗原抗体特异性结合的性质，先用乳胶包被抗原，再与相应血清反应，如几分钟内发生凝集，可判定有PRV感染。日本的柴因勋对比了LAT和SNT，检验了1 659份血清样品，发现LAT和SNT的相符程度达97.6%。且由于LAT可以检测有很强凝集活性的IgM，可以早于SNT检测到PR病毒的抗体。国内吴斌等(1997)做了同类试验也表明LAT和SNT间无统计上的差异。美国已经有商品化的LAT试剂盒供临床使用[5]，华中农大也于国内率先研制成功LAT试剂盒。LAT操作简单、方便、快速，且敏感性、特异性强，适用于疫病监测或流行病学调查，以及种猪群检疫净化阳性猪初次筛选。与SNT相比，LAT具有更加广阔的推广前景[6]。
2.3 免疫荧光试验
Stewart等(1967)首先应用荧光抗体染色法(immunofluorescence，IF)检查分别以病毒和病料接种的PK-15细胞培养物，获良好结果。用免疫荧光技术对采自不同组织的病料进行检测发现，扁桃体和淋巴结的检出率最高，其次是大脑、脾和脊髓。黄骏明等(1995)报导建立了检出率在95%以上的直接免疫荧光试验。取病猪的脑三叉神经、延脑和脊髓等组织作冰冻切片后免疫荧光检查，可于2 h～ 4 h内得到结果。此法是我国目前用于PR快速诊断的一种较好的方法。
2.4 酶联免疫吸附试验
酶联免疫吸附试验(enzyme-Iinked immunosorbent assay，ELISA) 具有快速、简便的优点，IgM-ELISA还可早期检测[7]。OIE将其作为诊断猪PR的首选血清学方法。美国也将ELISA作为3种PR的法定检测方法之一。
用ELISA检测PRV抗体的方法由Snyder等(1978)首创。Homme P等 (1997)将PRV gD基因在杆状病毒中表达，制成重组抗原并建立了竞争ELISA(cELISA)。用此法可检测到感染2周后血清阳转的情况。Gut M等[8]用同样载体表达了gE糖蛋白和gI糖蛋白，构建了直接竞争ELISA(gE/gI -ELISA)，试验证明gE/gI ELISA比gE-ELISA的敏感性和特异性更强，还可用于检测感染2周龄的早期感染猪血清中的抗体。
娄高明等(1998)建立了检测PRV抗原的双抗体夹心ELISA法，因其操作简便，不需要昂贵的仪器，因此适合大规模的检验检疫。四川农业大学的曹三杰等[9]建立了Dot-PPA-ELISA，可检测最低IgG含量为1.398×10－8g。中国农业科学院哈尔滨兽医研究所研制的Dot-ELISA试剂盒已投入使用[10]。
2.5 琼脂扩散试验
1977年Gutekunst D E等首次报道了利用微量免疫扩散试验(microimmunodiffusion test，MIDT)检测了2 200多头猪血清中的PRV抗体，其阳性结果与SNT相同[11]。此法所得结果不受血清污染、溶血和细胞毒素等条件的影响，具备经济和操作简便、重复性好、特异的优点，但敏感性不高。Willam P(1994)分别对MIDT、SNT、对流免疫电泳(countercurrent immunoelectrophoresis，CIE)进行了比较，3种方法的检测结果也很接近。国内的黄生(1989)、吴斌(1997)在做了同类的比较试验后认为MIDT操作简单，结果准确，适合基层和大型猪场使用。
2.6 血凝试验与血凝抑制试验
Tetsu N等(1989)发现PRV可以凝集Balb/c小鼠红细胞，并以此建立了PRV的血凝试验与血凝抑制试验(hemagglutination or HA-inhibition，HA或HI)，检查猪血清抗体的结果与SNT紧密相关，但是HI效价较低。Inaba Y将抗原与血清孵育时间延至48 h，再加补体继续孵育1 h，效价比前法高2倍～32倍。但是，Yamada S等研究发现gC-PrV 突变株不能凝集红细胞。吴平等(1991)用单克隆抗体致敏绵羊红细胞，建立了反向间接血凝抑制试验，SNT符合率为94%。
