牛冷冻精液国家标准
发布: 2011-06-25 | 作者: 佚名 | 来源: 转载
本标准适用于奶牛、兼用牛、肉牛和黄牛的冷冻精液产品。
1、规格与质量
1.1 剂型
细管、颗粒和安瓿
1.2 剂量
a.细管：中型0.5mL；微型0.25mL。
b.颗粒0.1mL土0.01mL。
c.安瓿0.5mL。
1.3 精子活力
解冻后的活力，指呈直线前进运动的精子百分率(下限)30％(即0.3)；精子复苏率(下限)50％。
1.4 每一剂量解冻后呈直线前进运动的精子数。
细管：每支(下限)1000万个。
颗粒：每粒(下限)l200万个。
安瓿：每支(下限)1500万个。
1.5 解冻后的精子畸形率(上限)20％；
1.6 解冻后的精子顶体完整率（下限）40％
1.7 解冻后的精液无病原性微生物，每毫升中细菌菌落数(上限)1000个。
1.8 解冻后的精子存活时间。
在5—8℃贮存时(下限)为12h；在37℃贮存时(下限)4h。
牛冷冻精液(以下简称“冻精”)，必须符合上述各项指标。否则，不得使用。
2、制作程序
2.1 采精
2.1.1 种公牛的质量
用子制作冻精的种公牛，其体型外貌和生产性能，均应合乎本品种的种用公牛特等、一等标准。在目前尚未建立国营种畜后裔测定站的地区，主力公牛必须经过种畜繁育场，进行后裔测定。由省、市、自治区级畜牧科研部门把关，未经后裔测定的种公牛的冻精， 必须经上级主管部门审批，严格控制使用。
2.1.2 种公牛的体质
种公牛必须体质健壮，新引进的公牛，应在隔离场所经过检疫。种公牛须经正式兽医机构和兽医师证明，无下列传染病者，如牛肺疫、布鲁氏杆菌病、牛结核病、牛副结核病、牛白血病、钩端螺旋体病、传染性鼻气管炎、病毒性腹泻病、胎儿弧菌和阴道滴虫症等，才允许使用。
上述各种疫病的检查方法，可按中华人民共和国农牧渔业部颁布的有关规定执行。
2.1.3 成年种公牛每周采精两次；每次也可根据具体情况和需要，连续排精两回。采精前，应先用温水洗公牛阴茎和包皮，然后再用灭菌生理盐水冲洗干净。
2.1.4 种公牛的新鲜精液，应符合下列质量标准。不具备其中任何一项者，不得用子制作冻精；
a. 新鲜精液的色泽应呈乳白稍带黄色。
b.直线前进运动精子(下限)60％。
c. 精子密度每毫升(下限)6.0亿。
d.精子畸形率(上限)15％。
2.2精液的稀释
2.2.1 稀释保护剂的配制。
2.2.1.1 配制冻精用的稀释保护剂，必须用新鲜的双重蒸馏水和卵黄，二级品以上的化学试剂。
2.2.1.2 所用器具，必须达到牛冷冻精液人工授精技术操作规程的标准，保证清洁、无菌。
2.2.1.3 推荐下列配方，作为冻精用稀释保护剂。
a.细管用：
第一液 蒸馏水100mL，柠檬酸钠2.978，卵黄10mL。
第二液 取第一液41.75mL，加入果糖2.5ｇ，甘油7mL。
脱脂奶82mL，卵黄10mL，甘油8mL。
b.颗粒用：
12％蔗糖液75mL，卵黄20mL，甘油5mL。
2.9％柠檬酸钠液73mL，卵黄20 mL，甘油7mL。
c.安瓿用：
可参照以上各种配方酌情使用。
上述各类稀释保护剂，在每100mL中，应加青霉素、链霉素各5万—10万单位。
稀释保护剂要现配现用；亦可配后放入4—5℃冰箱中备用，但不应超过1周。
2.2.2 稀释比例
不做具体规定，但必须保证每一剂量(细管、颗粒、安瓿)中，解冻后所含直线前进运动精子数的规定。
2.3 降温和平衡(预冷)
稀释后的精液，采用逐渐降温法。在1—1.5h内，使稀释精液的温度降到4—5℃；然后再在同温的恒温容器内平衡2—4h。2.4 冷冻
2.4.1 制备冻精的操作室，应符合牛人工授精技术操作规程。
2.4.2冻精的器具
2.4.2.1 细管冻精，应采用与细管配套的器具进行。
2.4.2.2 颗粒冻精，采用聚四氟乙烯板(简称氟板)、铜纱网、尼龙网或铝板均可。
2.4.2.3 安瓿冻精，采用净容量为0.5mL的硅酸盐中性玻璃安瓿。以上各种用具，在冻精时，精液容器与液氮面的距离，一般保持1—1.5cm，初冻温度-80—120℃。
精液在冷冻前，应充分混匀，并检查精子活力。
细管精液，不论是用聚乙醇封口、钢珠封口，还是超声波塑料热合，都必须将口封严。
颗粒精液。每毫升稀释精液，滴冻(10士1)粒，滴管应事先预冷。操作要准确、规整，每冻完一头公牛精液之后，必须更换滴管、 氟板等用具。 安瓿精液，用酒精喷灯火焰封口。在制作冻精时，不论是细管、颗粒和安瓿，均应始终注意防止精液湿度回升。 每冻完一批(头)精液，应立即故人液氮中泡浸，然后计数，取样检查和包装。
3 检查方法
3.1 精子活力检查
3.1.1 颗粒冻精，应先取2.9％二水柠檬酸铀1—1.5mL，加温到38℃土2℃，投放冻精一粒，轻轻摇荡，使之迅速溶化，用压片法，立即在显微镜下检查。
3.1.2 细管、安瓿冻精，解冻后应混匀，用压片法在显微镜下检查。
3.1.3 评定精子活力的显微镜放大倍数，以150—160为宜。
3.1.4 精子死亡百分率检查，可采用染色法或升温血球计计算法。
3.1.5 检查用的显微镜载物台温度，应保持38—40℃；也可
用显微镜和闭路电视的连接装置，在荧光屏上检查。
3.1.6 每批冻精，应随机取样两份，分别解冻检查。每个样品应观察3个以上的视野，注意不同液层内的精子运动状态，进行全面评定。
3.1.7 检查次数，应在冷冻后当时一次(或间隔24h再做一次)，合格者贮存。冻精发放前再抽样检查，合格者方准予发放。
3.2 精子密度检查
3.2.1 检查用具：以用血球计算器为准；用光电比色计或其他电子仪器检查，都必须用血球计算器做出可靠的校正值。
3.2.2 每批冻精应进行密度检查，以确定稀释比例。
3.3 精子畸形率定期抽样检查 取新鲜和解冻后的精液样品，放在载玻片上，按常规方法制成抹片，风干后在显微镜下检查畸形精子数，每个精液样品应观察精子总数500个，计算其中畸形精子百分率。不合格者，不得制作冷冻精液和贮存使用。
3.4 解冻后精子顶体完整率的定期抽样检查采用姬姆萨染色法镜检或用干扰相差(湿样品)镜检，每个样品观察精子总数500个。
3.5 冻精中细菌定期检查 取0.2mL解冻后的精液样品，放入血清琼脂平面上，在37℃恒温箱中培养24h，统计出现的菌落数。
3.6 解冻后的精子存活时间定期检查细管、安领冻精解冻后不再稀释；颗粒冻精以2.9％二水柠檬酸钠液解冻，在5—8℃或37℃下贮存，在38—40℃下镜检。 上述定期抽样检查，每头公牛每月(下限)1次。
4 使用方法
4.1 解冻
4.1.1 细管、安瓿冻精，可用38℃土2℃温水直接浸泡解冻。
4.1.2 颗粒冻精，应一次一粒，用38℃土2℃1—1.5mL解冻液解冻；多于两粒时，应分别解冻。
4.1.3 解冻液配制
a.配制2.9％二水柠檬酸钠液，用2mL灭菌安瓿封装，解冻液净容量(下限)1.5mL。
b.蒸馏水100mL，葡萄糖3.0g，柠檬酸钠1.4g。
c.蒸馏水100 g，柠檬酸钠1.7g，蔗糖1.15g，氨苯磺胺0.3g，磷酸二氢钾0.325g，碳酸氢钠0.098，青霉素、链霉素各l0万单位。
4.1.4 解冻后的使用时间
细管和安瓿精液(上限)为1h；颗粒精液(上限)为2h。如解冻后的精液需要外运时；应采取低温(10—15℃)解冻，然后用脱脂棉或多层纱布包裹，外边用塑料袋包好，置4—5℃下保存。其使用时间(上限)为8h。
4.2 输精
4.2.1 每头发情母牛，每次输精应用解冻精液一个剂量(细管、颗粒或安瓿)。输精之前，必须再进行一次精子活力评定，不够标准者不许使用。
4.2.2应推行直肠把握子宫颈深部输精法
4.2.3 每一情期输精1—2次。要做到输精适时和输精器适深，慢插、轻注、缓出，防止精液逆流。
5 包装、标记、贮存和运输
5.1 包装
5.1.1 细管冻精应封闭良好
5.1.2 颗粒冻精必须用无菌容器包装。每一容器以装冻精50—100粒为一个单位。
5.1.3 安瓿冻精可放在液氮生物容器的提筒中，应防止碰撞。
5.2 标记
5.2.1 细管、安瓿表面和盛装颗粒冻精的容器外面，均应有鲜明的标记。注明站代号[按国家统一规定的省、市、自治区的代号]、公牛品种、名号、精液制冻日期(年、月、日或批号)以及该批冻精的精子活力和份数。
5.2.2 不同品种公牛的冻精，可用不同颜色包装加以区别；其包装颜色和公牛品种、品种代号见表。5.3 贮存
5.3.1 用干冰贮存时，应根据贮存容器的大小，及时补充干冰，包装的精液不得外露。
5.3.2 用液氮生物容器贮存时，容器内液氮必须浸没冻精。
5.3.3 应经常检查液氮生物容器的状况，如发现容器异常，应当将冻精转移到其他完好的容器内。
5.3.4 取放冻精之后，应及时盖好容器塞，防止液氮蒸发或异物浸入。
5.3.5 液氮生物容器，应在使用前后彻底检查和清洗。清理时，先用中性洗涤剂刷洗，再用40—45℃温水冲洗干净，在室温下放置48h以上再充入液氮。长期贮存冻精的容器，应定期清理和洗刷。
公牛品种 冻精包装容器颜色 品种代号
（细管、颗粒、安瓿）
奶牛 中国黑白花 白色 HB
沙西瓦 SX
兼用牛 西门塔尔 粉红色 XM
苏系 S—XM
德系 D—XM
奥系 A—XM
瑞系 R—XM
兼用短角 JD
草原红牛 CH
新疆褐牛 XH
三河牛 SH
肉牛 肉用短角 草绿色 RD
夏洛来 XL
海福特 HF
安格斯 AG
利木赞 LM
莫累灰 ML
圣格特鲁迪斯 草绿色 SG
抗旱王 KH
辛地红 XD
婆罗门 PM
婆拉福 PL
黄牛 南阳牛 浅黄色 NY
秦川牛 QC
延边牛 YB
鲁西黄牛 LX
晋南牛 JN
复州牛 PZ
朝鲜牛 CX
蒙古牛 MG
5.3.6 取放冻精时，提筒只许提到容器的颈下，严禁提到外边，停留时间(上限)10 s。如向另一容器转移冻精时，盛冻精的提筒离开液氮面的时间(上限)5s。
5.3.7 大型液氯生物容器，应有冻精分类存放位置的详细图表，分别注册，登记清楚，并应备有足够的液氯生物容器，严防不同品种和不同个体公牛的冻精混淆。无继续贮存价值的冻精，应及时报请上级主管部门批准，妥善销毁。
5.4 运输
5.4.1 移动液氮生物容器时，应把握其手柄，轻拿轻放，防止冲撞。
5.4.2 贮精和贮液氮的生物容器，均不可横放、叠放或倒置。装车运输时，应在车箱板上加防震胶垫、毡垫或泡沫塑料垫。容器加外套，并根据运输条件，用厚纸箱或木箱装好，牢固地系在车上，严防撞击倾倒。
5.4.3 运输冻精时，应有专人负责，办好交接手续(应附带精液运输、交接卡片)。途中应及时检查和补充冷源。
5.4.4用干冰运输冻精时，液氮生物容器必须盖严，干冰必须敷过冻精。
1、规格与质量
1.1 剂型
细管、颗粒和安瓿
1.2 剂量
a.细管：中型0.5mL；微型0.25mL。
b.颗粒0.1mL土0.01mL。
c.安瓿0.5mL。
1.3 精子活力
解冻后的活力，指呈直线前进运动的精子百分率(下限)30％(即0.3)；精子复苏率(下限)50％。
1.4 每一剂量解冻后呈直线前进运动的精子数。
细管：每支(下限)1000万个。
颗粒：每粒(下限)l200万个。
安瓿：每支(下限)1500万个。
1.5 解冻后的精子畸形率(上限)20％；
1.6 解冻后的精子顶体完整率（下限）40％
1.7 解冻后的精液无病原性微生物，每毫升中细菌菌落数(上限)1000个。
1.8 解冻后的精子存活时间。
在5—8℃贮存时(下限)为12h；在37℃贮存时(下限)4h。
牛冷冻精液(以下简称“冻精”)，必须符合上述各项指标。否则，不得使用。
2、制作程序
2.1 采精
2.1.1 种公牛的质量
用子制作冻精的种公牛，其体型外貌和生产性能，均应合乎本品种的种用公牛特等、一等标准。在目前尚未建立国营种畜后裔测定站的地区，主力公牛必须经过种畜繁育场，进行后裔测定。由省、市、自治区级畜牧科研部门把关，未经后裔测定的种公牛的冻精， 必须经上级主管部门审批，严格控制使用。
2.1.2 种公牛的体质
种公牛必须体质健壮，新引进的公牛，应在隔离场所经过检疫。种公牛须经正式兽医机构和兽医师证明，无下列传染病者，如牛肺疫、布鲁氏杆菌病、牛结核病、牛副结核病、牛白血病、钩端螺旋体病、传染性鼻气管炎、病毒性腹泻病、胎儿弧菌和阴道滴虫症等，才允许使用。
上述各种疫病的检查方法，可按中华人民共和国农牧渔业部颁布的有关规定执行。
2.1.3 成年种公牛每周采精两次；每次也可根据具体情况和需要，连续排精两回。采精前，应先用温水洗公牛阴茎和包皮，然后再用灭菌生理盐水冲洗干净。
2.1.4 种公牛的新鲜精液，应符合下列质量标准。不具备其中任何一项者，不得用子制作冻精；
a. 新鲜精液的色泽应呈乳白稍带黄色。
b.直线前进运动精子(下限)60％。
c. 精子密度每毫升(下限)6.0亿。
d.精子畸形率(上限)15％。
2.2精液的稀释
2.2.1 稀释保护剂的配制。
2.2.1.1 配制冻精用的稀释保护剂，必须用新鲜的双重蒸馏水和卵黄，二级品以上的化学试剂。
2.2.1.2 所用器具，必须达到牛冷冻精液人工授精技术操作规程的标准，保证清洁、无菌。
2.2.1.3 推荐下列配方，作为冻精用稀释保护剂。
a.细管用：
第一液 蒸馏水100mL，柠檬酸钠2.978，卵黄10mL。
第二液 取第一液41.75mL，加入果糖2.5ｇ，甘油7mL。
脱脂奶82mL，卵黄10mL，甘油8mL。
b.颗粒用：
12％蔗糖液75mL，卵黄20mL，甘油5mL。
2.9％柠檬酸钠液73mL，卵黄20 mL，甘油7mL。
c.安瓿用：
可参照以上各种配方酌情使用。
上述各类稀释保护剂，在每100mL中，应加青霉素、链霉素各5万—10万单位。
稀释保护剂要现配现用；亦可配后放入4—5℃冰箱中备用，但不应超过1周。
2.2.2 稀释比例
不做具体规定，但必须保证每一剂量(细管、颗粒、安瓿)中，解冻后所含直线前进运动精子数的规定。
2.3 降温和平衡(预冷)
稀释后的精液，采用逐渐降温法。在1—1.5h内，使稀释精液的温度降到4—5℃；然后再在同温的恒温容器内平衡2—4h。2.4 冷冻
2.4.1 制备冻精的操作室，应符合牛人工授精技术操作规程。
2.4.2冻精的器具
2.4.2.1 细管冻精，应采用与细管配套的器具进行。
2.4.2.2 颗粒冻精，采用聚四氟乙烯板(简称氟板)、铜纱网、尼龙网或铝板均可。
2.4.2.3 安瓿冻精，采用净容量为0.5mL的硅酸盐中性玻璃安瓿。以上各种用具，在冻精时，精液容器与液氮面的距离，一般保持1—1.5cm，初冻温度-80—120℃。
精液在冷冻前，应充分混匀，并检查精子活力。
细管精液，不论是用聚乙醇封口、钢珠封口，还是超声波塑料热合，都必须将口封严。
颗粒精液。每毫升稀释精液，滴冻(10士1)粒，滴管应事先预冷。操作要准确、规整，每冻完一头公牛精液之后，必须更换滴管、 氟板等用具。 安瓿精液，用酒精喷灯火焰封口。在制作冻精时，不论是细管、颗粒和安瓿，均应始终注意防止精液湿度回升。 每冻完一批(头)精液，应立即故人液氮中泡浸，然后计数，取样检查和包装。
3 检查方法
3.1 精子活力检查
3.1.1 颗粒冻精，应先取2.9％二水柠檬酸铀1—1.5mL，加温到38℃土2℃，投放冻精一粒，轻轻摇荡，使之迅速溶化，用压片法，立即在显微镜下检查。
3.1.2 细管、安瓿冻精，解冻后应混匀，用压片法在显微镜下检查。
3.1.3 评定精子活力的显微镜放大倍数，以150—160为宜。
3.1.4 精子死亡百分率检查，可采用染色法或升温血球计计算法。
3.1.5 检查用的显微镜载物台温度，应保持38—40℃；也可
用显微镜和闭路电视的连接装置，在荧光屏上检查。
3.1.6 每批冻精，应随机取样两份，分别解冻检查。每个样品应观察3个以上的视野，注意不同液层内的精子运动状态，进行全面评定。
3.1.7 检查次数，应在冷冻后当时一次(或间隔24h再做一次)，合格者贮存。冻精发放前再抽样检查，合格者方准予发放。
3.2 精子密度检查
3.2.1 检查用具：以用血球计算器为准；用光电比色计或其他电子仪器检查，都必须用血球计算器做出可靠的校正值。
3.2.2 每批冻精应进行密度检查，以确定稀释比例。
3.3 精子畸形率定期抽样检查 取新鲜和解冻后的精液样品，放在载玻片上，按常规方法制成抹片，风干后在显微镜下检查畸形精子数，每个精液样品应观察精子总数500个，计算其中畸形精子百分率。不合格者，不得制作冷冻精液和贮存使用。
3.4 解冻后精子顶体完整率的定期抽样检查采用姬姆萨染色法镜检或用干扰相差(湿样品)镜检，每个样品观察精子总数500个。
3.5 冻精中细菌定期检查 取0.2mL解冻后的精液样品，放入血清琼脂平面上，在37℃恒温箱中培养24h，统计出现的菌落数。
3.6 解冻后的精子存活时间定期检查细管、安领冻精解冻后不再稀释；颗粒冻精以2.9％二水柠檬酸钠液解冻，在5—8℃或37℃下贮存，在38—40℃下镜检。 上述定期抽样检查，每头公牛每月(下限)1次。
4 使用方法
4.1 解冻
4.1.1 细管、安瓿冻精，可用38℃土2℃温水直接浸泡解冻。
4.1.2 颗粒冻精，应一次一粒，用38℃土2℃1—1.5mL解冻液解冻；多于两粒时，应分别解冻。
4.1.3 解冻液配制
a.配制2.9％二水柠檬酸钠液，用2mL灭菌安瓿封装，解冻液净容量(下限)1.5mL。
b.蒸馏水100mL，葡萄糖3.0g，柠檬酸钠1.4g。
c.蒸馏水100 g，柠檬酸钠1.7g，蔗糖1.15g，氨苯磺胺0.3g，磷酸二氢钾0.325g，碳酸氢钠0.098，青霉素、链霉素各l0万单位。
4.1.4 解冻后的使用时间
细管和安瓿精液(上限)为1h；颗粒精液(上限)为2h。如解冻后的精液需要外运时；应采取低温(10—15℃)解冻，然后用脱脂棉或多层纱布包裹，外边用塑料袋包好，置4—5℃下保存。其使用时间(上限)为8h。
4.2 输精
4.2.1 每头发情母牛，每次输精应用解冻精液一个剂量(细管、颗粒或安瓿)。输精之前，必须再进行一次精子活力评定，不够标准者不许使用。
4.2.2应推行直肠把握子宫颈深部输精法
4.2.3 每一情期输精1—2次。要做到输精适时和输精器适深，慢插、轻注、缓出，防止精液逆流。
5 包装、标记、贮存和运输
5.1 包装
5.1.1 细管冻精应封闭良好
5.1.2 颗粒冻精必须用无菌容器包装。每一容器以装冻精50—100粒为一个单位。
5.1.3 安瓿冻精可放在液氮生物容器的提筒中，应防止碰撞。
5.2 标记
5.2.1 细管、安瓿表面和盛装颗粒冻精的容器外面，均应有鲜明的标记。注明站代号[按国家统一规定的省、市、自治区的代号]、公牛品种、名号、精液制冻日期(年、月、日或批号)以及该批冻精的精子活力和份数。
5.2.2 不同品种公牛的冻精，可用不同颜色包装加以区别；其包装颜色和公牛品种、品种代号见表。5.3 贮存
5.3.1 用干冰贮存时，应根据贮存容器的大小，及时补充干冰，包装的精液不得外露。
5.3.2 用液氮生物容器贮存时，容器内液氮必须浸没冻精。
5.3.3 应经常检查液氮生物容器的状况，如发现容器异常，应当将冻精转移到其他完好的容器内。
5.3.4 取放冻精之后，应及时盖好容器塞，防止液氮蒸发或异物浸入。
5.3.5 液氮生物容器，应在使用前后彻底检查和清洗。清理时，先用中性洗涤剂刷洗，再用40—45℃温水冲洗干净，在室温下放置48h以上再充入液氮。长期贮存冻精的容器，应定期清理和洗刷。
公牛品种 冻精包装容器颜色 品种代号
（细管、颗粒、安瓿）
奶牛 中国黑白花 白色 HB
沙西瓦 SX
兼用牛 西门塔尔 粉红色 XM
苏系 S—XM
德系 D—XM
奥系 A—XM
瑞系 R—XM
兼用短角 JD
草原红牛 CH
新疆褐牛 XH
三河牛 SH
肉牛 肉用短角 草绿色 RD
夏洛来 XL
海福特 HF
安格斯 AG
利木赞 LM
莫累灰 ML
圣格特鲁迪斯 草绿色 SG
抗旱王 KH
辛地红 XD
婆罗门 PM
婆拉福 PL
黄牛 南阳牛 浅黄色 NY
秦川牛 QC
延边牛 YB
鲁西黄牛 LX
晋南牛 JN
复州牛 PZ
朝鲜牛 CX
蒙古牛 MG
5.3.6 取放冻精时，提筒只许提到容器的颈下，严禁提到外边，停留时间(上限)10 s。如向另一容器转移冻精时，盛冻精的提筒离开液氮面的时间(上限)5s。
5.3.7 大型液氯生物容器，应有冻精分类存放位置的详细图表，分别注册，登记清楚，并应备有足够的液氯生物容器，严防不同品种和不同个体公牛的冻精混淆。无继续贮存价值的冻精，应及时报请上级主管部门批准，妥善销毁。
5.4 运输
5.4.1 移动液氮生物容器时，应把握其手柄，轻拿轻放，防止冲撞。
5.4.2 贮精和贮液氮的生物容器，均不可横放、叠放或倒置。装车运输时，应在车箱板上加防震胶垫、毡垫或泡沫塑料垫。容器加外套，并根据运输条件，用厚纸箱或木箱装好，牢固地系在车上，严防撞击倾倒。
5.4.3 运输冻精时，应有专人负责，办好交接手续(应附带精液运输、交接卡片)。途中应及时检查和补充冷源。
5.4.4用干冰运输冻精时，液氮生物容器必须盖严，干冰必须敷过冻精。
TAG:
精液
